Antigeny

Definice antigenů na základě 4 imunologických vlastností: imunogenity, antigenity, alerogenity a tolerogenity.

Imunogenita - schopnost vyvolat humorální nebo buněčnou imunitní odpověď (antigen=imunogen).
Antigenita - schopnost specificky se vázat s finálními produkty imunitních reakcí (hapteny mají vlastnosti antigenů ale ne imunogenů).
Alerogenita - schopnost vyvolat alergickou reakci.
Tolerogenita - schopnost indukovat specifickou imunologickou neodpovídavost.
Imunogeny- proteiny nebo polysacharidy, nikoli lipidy nebo nukleové kyseliny (pouze v komplexu s proteinem nebo polysacharidem).Pro buněčnou imunitu slouží jako imunogeny pouze proteiny.

Imunogenita je určena cizorodostí, molekulární hmotností a chemickým složením a degradovatelností makrofágovými enzymy.
Cizorodost: všechny molekuly ke kterým jedinec nezíská toleranci během fetálního vývoje jsou rozpoznávány jako cizí.Čím větší je fylogenetická vzdálenost mezi druhy, tím větší je antigenní odlišnost mezi nimi. Některé komponenty vlastního těla (tkáň rohovky, sperma) jsou tak dobře odděleny od imunitního systému, že když se injikují do jedince ze kterého byly získány, vyvolají imunitní odpověď.
Molekulová hmotnost: nejlepší imunogeny mají m.h. kolem 100 kDa. Molekuly menší než 5-10 kDa jsou slabé imunogeny.
Chemické složení a heterogenita: syntetické homopolymery postrádají imunogenitu bez ohledu na velikost. Kopolymery dostatečné velikosti obsahující dvě nebo více AK jsou imunogenní. Primární, sekundární terciární i kvarterní struktura antigenu ovlivňují jeho imunogenitu.
Degradovatelnost: makromolekuly, které nemohou být degradovány a zpracovány buňkami prezentujícími antigen, jsou špatné imunogeny (např. syntetické polymery z D-aminokyselin). Ke zvýšení imunogenity se užívá chemického propojení makromolekul, agregace teplem a navázání na nerozpustné matrice.

Vliv biologického systému na imunogenitu:
Genetická konstituce imunizovaného zvířete ovlivňuje typ imunitní odpovědi i její velikost. Imunitní odpověď je řízena geny MHC. Proteiny MHC, které fungují při prezentaci antigenu T buňkám, hrají hlavní úlohu v určení stupně odpovídavosti na antigen. Dále je imunitní odpověď ovlivňována geny kódujícími T a B receptory a geny kódujícími různé regulační proteiny.
Dávka imunogenu a způsob podání: 
Výsledek imunizace závisí na kombinaci dávky, způsobu podání a časového schematu. Příliš nízká nebo příliš vysoká dávka může vyvolat neodpovídavost (toleranci). Obvykle je třeba více dávek antigenu. Antigen podaný intravenózně se nejprve dostává do sleziny, antigen podaný podkožně jde do lokálních lymfatických uzlin.

Adjuvancia:
Z latiny - adjuvare = pomoci. Zvyšují imunogenitu antigenu.
Např. síran hlinitodraselný (alum) precipituje antigen a pomalu ho uvolňuje z místa injekce. Freundovo adjuvans obsahuje minerální olej ve vodě a emulsifikátor. Malé kapky oleje obklopují antigen, který je pak uvolňován velmi pomalu. Kompletní Freundovo adjuvans obsahuje navíc teplem usmrcená mykobakteria, jejichž stěnová složka - muramyl dipeptid aktivuje makrofágy, které produkcí IL-1 aktivují Th buňky. Jiná adjuvancia jako polyribonukleotidy nebo lipopolysacharidy nespecificky stimulují lymfocytární proliferaci a tak zvyšují pravděpodobnost antigenem indukované klonální selekce. Některá adjuvancia vyvolávají chronické záněty s granulomy.Vysoké počty makrofágů v granulomu usnadňují zpracování antigenu a stimulují aktivaci Th buněk.
Epitopy (antigenní determinanty):
Jsou to imunologicky aktivní oblasti imunogenu, které se váží na membránové receptory lymfocytů nebo sekretované protilátky. Protože B buňky váží volný antigen v roztoku, jsou příslušné epitopy přístupná místa povrchu imunogenu. Obecně obsahují hydrofilní AK.
Velikost B epitopů je určena velikostí vazebného místa pro antigen (paratopu) na protilátkové molekule. Vazba protilátky s epitopem zahrnuje slabé nekovalentní interakce, které fungují na krátké vzdálenosti a proto závisí na komplementaritě epitopu a paratopu, aby se tyto interakce maximalizovaly. 15-22 AK na povrchu proteinového antigenu přichází do kontaktu s podobným počtem AK v paratopu. Jako B epitopy jsou většinou rozpoznávány oblasti vyčnívající z povrchu proteinu. B epitopy mohou být sekvenční nebo konformační. Sekvenční epitopy zahrnují určitou sekvenci AK v peptidickém řetězci, AK tvořící konformační epitopy jsou daleko, od sebe v primární struktuře, ale dostávají se k sobě v terciární struktuře proteinu. Jsou závislé na nativní konformaci proteinu. B epitopy bývají lokalizovány ve flexibilních oblastech imunogenu a vykazují pohyblivost. Komplexní proteiny obsahují mnohočetné překrývající se B epitopy. Imunodominantní epitopy indukují silnější odpověď než ostatní epitopy. Je to dáno topografickými vlastnostmi epitopů i regulačními mechanismy zvířete.
T epitopy: jako T epitopy fungují oligomerické peptidy obsahující 7-20 AK. Antigenní peptidy rozpoznávané T buňkami tvoří trimolekulární komplexy s T receptorem a MHC molekulou. Byla krystalizována MHC I molekula obsahující malý peptid, zřejmě zpracovaný antigen. Antigen rozpoznávaný T buňkami musí nést dvě interakční místa: jedno (epitop) interaguje s T receptorem, druhé (agretop) interaguje s MHC molekulou. Vazba peptidu na MHC nevykazuje takovou antigenní specifitu jako interakce protilátka-epitop. Peptidy schopné specifické interakce s MHC molekulami vznikají při zpracování antigenu. Pouze jedna hodina stačí antigen prezentující buňce k tomu, aby zpracovala antigen a prezentovala ho na své membráně.
Antigeny rozpoznávané T buňkami často obsahují amfifatické peptidy. Hydrofobní AK zbytky zřejmě fungují jako agretopy, zatímco hydrofilní jako epitopy. Byl vypracován počítačový program analyzující peptidové sekvence a přiřazující jim "amfifatický index". To umožňuje předpovědět potenciální T epitopy pro syntetické peptidové vakcíny proti infekčním nemocem. Imunodominantní T epitopy jsou částečně určeny povrchovými molekulami MHC exprimovanými jedincem.

Hapteny:
Jsou to malé organické molekuly vázané na velký proteinový nosič. Konjugát hapten-nosič je použit k imunizaci. Indukované protilátky jsou namířeny jak proti haptenu, tak proti nosiči. Hapten vlastně funguje jako imunodominantní epitop na molekule nosiče. Pomocí haptenů byl studován vliv změny chemické struktury antigenu na jeho reaktivitu s protilátkou. Pozměněné hapteny, které ještě reagovaly s protilátkou proti původnímu haptenu byly označeny jako skříženě reagující.
Mnoho biologicky aktivních látek (léky , peptidické hormony, steroidní hormony) může fungovat jako hapteny.

Virové a bakteriální antigeny:
Složení virové částice - nukleokapsida (kapsomery) a lipoproteinový obal. Podjednotkové struktury kapsidy (u nahých virů) a glykoproteinové výběžky obalených virů = B epitopy. T epitopy jsou často na vniřních virových proteinech produkovaných v hostitelských buňkách. Např. hlavním antigenem rozpoznávaným Tc buňkami je u viru chřipky nukleoprotein spojený s virovou RNA a nacházející se pod glykoproteinovým obalem. Virus chřipky průběžně mění AK složení svých obalových glykoproteinů. Velká změny (antigenní shift) nebo menší (antigenní drift) vedou ke vzniku nových epitopů, umožňujících viru uniknout obranným imunitním mechanismům, což vede ke chřipkovým epidemiím. Podobné časté změny v obalových glykoproteinech jsou pozorovány u HIV (virus AIDS), což komplikuje vývoj vakcíny.
Buněčná stěna grampozitivních bakterií je složená převážně z peptidoglykanu (polysdacharidy propojené krátkými polypeptidickými řetězci). Gramnegativní bakterie mají tenkou peptidoglykanovou vrstvu pokrytou vnější membránou obsahující fosfolipid, protein, lipopolysdacharid a lipoprotein. Lipopolysacharid je hlavní antigenní komponentou. Bakteriální pouzdra jsou složená z polysachridů nebo polypeptidů a jsou důležitým faktorem virulence bakterií, protože interferují s fagocytózou.

Mitogeny:
Jsou to látky, které indukují buněčné dělení u vysokého procenta T nebo B buněk. Jsou to nespecifické polyklonální aktivátory. Patří mezi ně lektiny, což jsou proteiny rostlinného původu vázající cukry. Rozpoznávají různé glykoproteiny na povrchu buněk včetně lymfocytů. Nejznámější jsou konkanavalin A (Con A), tetramer schopný přemostit glykoproteiny na buněčném povrchu a tak aktivovat buňky. Je to T mitogen podobně jako fytohemaglutinin (PHA), který se získává z fazolí a aspecificky rozpoznává N-acetylgalaktosamín. Pokeweed mitogen (PWM) je mitogenní pro T i B buňky. Důležitým nelektinovým B mitogenem je lipopolysacharid (LPS), komponenta bakteriální stěny gramnegativních bakterií. Vlastní aktivita je nesena lipidem A, který reaguje s plasmatickou membránou.
Neobvyklou skupinou polyklonálních aktivátorů jsou superantigeny. Aktivují všechny T lymfocyty exprimující společnou sekvenci na T receptoru bez ohledu na jejich antigenní nebo MHC specifitu. Rozpoznávají AK sekvence mimo vazebné místo pro antigen. Vážou se současně na T receptor a MHC molekulu a aktivují velké množství T buněk. Patří sem stafylokokové enterotoxiny a toxin šokového syndromu produkovaný bakterií Staphylococcus aureus. Každý pátý T lymfocyt může být aktivován tímto toxinem, což vede k produkci abnormálního množství cytokínů, k šoku a smrti.

Struktura a funkce imunoglobulinů

Sérové protilátky jsou obsaženy v gamaglobulinové frakci séra (Tiselius a Kabat 1939). Označují se jako imunoglobuliny.
Základní studie struktury imunoglobulinů provedli Porter a Edelman (Nobelova cena v roce 1972). Porter štěpil molekulu IgG rostlinným enzymem papainem za vzniku dvou identických Fab fragmentů nesoucích antigen vazebnou aktivitu a Fc fragmentu, který bylo možno získat krystalizací. Štěpení jinou proteinázou - pepsinem (Nisonoff) poskytlo jeden F(ab)2 fragment, Fc fragment nebyl získán, protože byl rozštípán na mnoho fragmentů. Edelman redukoval disulfidické vazby v molekule IgG merkaptoetanolem a denaturovaný protein podrobil elektroforéze ve škrobovém gelu. Tyto pokusy ukázaly, že molekula IgG se skládá ze dvou identických těžkých peptidických řetězců o m.h. 50 kDa a dvou stejných lehkých řetězců o m.h. 25 kDa. Těžké a lehké řetězce jsou spojeny disulfidickými můstky. Papain štěpí IgG molekulu těsně nad S-S můstkem spojujícím těžké řetězce, pepsin štěpí těsně pod ním.
Zjištění primární struktury imunoglobulinů (sekvenace) bylo dlouho limitováno velkou heterogenitou sérových imunoglobulinů. Sekvenaci umožnilo teprve objevení mnohotných myelomů - nádorů postihujících plasmatické buňky. Zatímco normální plazmatické buňky produkují protilátky po několik dnů a pak hynou, myelomové buňky produkují imunoglobuliny neomezeně, takže myelomový protein představuje 95% sérových imunoglobulinů. Většina pacientů s mnohotným myelomem ještě produkuje nadbytek lehkých řetězců, které mohou být nalezeny v moči jako Bence-Jonesovy proteiny. Mnohotný myelom lze vyvolat u myší injekcí minerálního oleje do peritoneální dutiny.
Sekvenování lehkých imunoglobulinových řetězců ukázalo, že oblast zahrnující asi 110 AK na N-konci řetězce je vysoce variabilní, zatím co C-konec byl označen jako konstantní, vyskytující se ve dvou typech kapa a lambda. U lidí je poměr mezi kapa a lambda řetězci 2:1, u myší je 95% lehkých řetězců typu kapa. Jedna protilátková molekula má vždy pouze jeden typ lehkých řetězců, nikdy oba.
Sekvenování těžkých řetězců ukázalo také variabilní oblast (100-110 AK) na N-konci, zbytek (konstantní oblast) se vyskytoval v pěti typech uspořádání aminokyselin, což odpovídá pěti známým třídám imunoglobulinů IgM, IgG, IgA, IgD a IgE. Délka konstantní oblasti byla 330 AK pro IgA, IgG a IgD a 440 AK pro IgM a IgE. Každá protilátková molekula má dva stejné těžké řetězce (označené podle tříd ) a dva stejné lehké řetězce kapa nebo lambda.

Struktura imunoglobulinové molekuly:
Je určena primární, sekundární, terciární a kvarterní strukturou proteinové molekuly. Primární struktura zodpovídá za konstantní a variabilní oblasti lehkých a těžkých řetězců. Sekundární struktura tvoří tzv. skládaný list, který je stabilizován disulfidickými a vodíkovými můstky. Řetězce jsou v terciární struktuře poskládány do kompaktních globulárních domén. Globulární domény sosedících lehkých a těžkých řetězců interagují ve kvarterní struktuře tvořící funkční domény, umožňující specifickou vazbu antigenu a další biologické funkce.

Struktura imunoglobulinových domén:
Struktura lehkých i těžkých řetězců se skládá z homologních jednotek (asi 110 AK) nazvaných domény. Každá doména obsahuje jednu disulfidickou smyčku, zahrnující asi 60 AK. L řetězce obsahují jednu variabilní a jednu konstantní doménu, těžké řetězce jednu variabilní a 3 nebo 4 konstantní domény podle protilátkové třídy. Krystalografické studie ukázaly, že Ig domény jsou poskládány do charakteristické struktury (immunoglobulin fold).

Struktura a funkce variabilní domény:
Variabilní doména obsahuje tři hypervariabilní oblasti v L i H řetězcích. Tyto oblasti zahrnují 15-20% variabilní domény, zbytek se označuje jako kostra. Hypervariabilní oblasti tvoří vazebné místo pro antigen. Protože struktura vazebného místa je komplementární ke struktuře antigenního epitopu, jsou hypervariabilní oblasti nazývány oblasti určující komplementaritu (CDR). Úloha CDR ve vazbě antigenu byla demonstrována pomocí techniky afinitního značení (affinity labeling). Tato technika využívá syntetického haptenu obsahujícího skupiny, které mohou být převedeny do chemicky reaktivního stavu po aktivaci ultrafialovým světlem. Aminokyseliny tvořící vazebné místo jsou pak kovalentně vázány s haptenem a mohou být identifikovány. Tato analýza ukázala, že CDR vyčnívají z Ig struktury a vytvářejí vazebné místo pro antigen. V daném případě interagovalo 17 AK protilátky s 16 AK antigenu. V některých případech (protilátka proti neuraminidáze chřipkového viru) je tvorba komplexu antigen-protilátka provázena konformačními změnami jak antigenního epitopu, tak paratopu.

Struktura a funkce domén konstantní oblasti:
Těžké řetězce IgG, IgD a IgA obsahují peptidovou sekvenci mezi CH1 a CH2 doménami která je ozanačována jako peptidický pant (hinge region) a která umožňuje pohyblivost Fab řetězců v tom smyslu, že mohou navzájem svírat různý úhel podle velikosti antigenu, který vážou. Flexibilita peptidického pantu byla demonstrována na elektronoptických snímcích komplexů antigen-protilátka. Protilátky třídy IgM a IgE nemají hinge region, ale mají navíc 110 AK doménu s podobnými vlastnostmi.
CH2/CH2 domény jsou odděleny oligosacharidovými postranními řetězci což vede k tomu, že tyto dvě globulární domény jsou mnohem přístupnější okolnímu prostředí a mohou hrát úlohu v aktivaci komplementu.
 Poslední C-koncová doména protilátkové molekuly vázané na membránu funguje v připojení této molekuly k B buňce. U volných protilátkových molekul tato doména spolu s přilehlou doménou interaguje s Fc receptorem na různých buňkách. Např. některé podtřídy IgG se váží na receptor na placentálních buňkách a jsou pak přenášeny přes placentu, což umožňuje mateřským protilátkám chránit plod. Vazba IgE na žírné buňky a bazofily je také zprostředkována Fc receptory na těchto buňkách. C-koncová doména IgA a IgM hraje úlohu v polymerizaci volných molekul těchto protilátek. Přítomnost cysteinových zbytků umožňuje tvorbu S-S můstků což vede ke vzniku pentamerů u IgM a dimerů nebo trimerů u IgA.

Antigenní determinanty na imunoglobulinech:
Imunoglobuliny jsou glykoproteiny, které mohou fungovat jako silné imunogeny. Epitopy na Ig molekulách spadají do tří kategorií: izotypy, alotypy a idiotypy.
Izotypové determinanty: leží v konstantních oblastech těžkých a lehkých řetězců a odlišují třídu a podtřídu u těžkých řezězců a typ a subtyp u lehkých řetězců v rámci druhu. To znamená, že všichni jedinci určitého druhu nesou stejné geny pro konstantní oblast. Odlišné druhy exprimují odlišné izotypy.
Antigenní determinanty: které odlišují imunoglobuliy stejného izotypu u různých jedinců téhož druhu se nazývají alotypovými determinantami (je známo 25 Gm alotypů u lidí). Antialotypové protilátky jsou někdy tvořeny matkou proti otcovským alotypovým determinantám na fetálních imunoglobulinech nebo po krevní transfuzi.
Jedinečná AK sekvence VH a VL domén obsahující paratop může fungovat jako antigenní determinanta. Každá jednotlivá determinanta variabilní oblasti se nazývá idiotop. Některé idiotopy mohou být totožné s vazebným místem pro antigen, jiné leží mimo paratop. Suma všech idiotopů na jedné protilátkové molekule se nazývá idiotyp protilátky. Některé idiotypové determinanty jsou shodné na různých protilátkách (public idiotopes). Dokazují expresi téhož genu zárodečné linie u různých B buněk.

Izotypy imunoglobulinů:
Imunoglobulin G - je nejčastějším izotypem v séru (80% všech sérových Ig). Existují 4 podtřídy IgG1-4. Rozdíly mezi podtřídami jsou velikost hinge region a počet a umístění S-S můstků. IgG1, 3 a 4 procházejí placentou, IgG3 nejefektivněji aktivuje complement, IgG4 neaktivuje komplement vůbec. Podtřídy se liší i v afinitě k Fc receptorům.
Imunoglobulin M - tvoří 5-10% sérových Ig. Monomerický IgM je exprimován na B buňkách, sekretovaný IgM je pentamer, obsahující polypeptidický J řetězec, navázaný na C-koncové cysteinové zbytky na dvou z 10 H řetězců. J řetězec je asi nezbytný pro polymerizaci monomerních IgM molekul. IgM je produkován jako první v primární odpovědi na antigen a je prvním izotypem tvořeným u novorozenců. Molekula pentameru obsahuje 10 vazebných míst pro antigen a může vázat 10 malých haptenových molekul. U větších antigenů sterická zábrana omezuje vazebnou kapacitu na polovinu. IgM velmi účinně aglutinuje a neutralizuje viry, je účinnější než IgG v aktivaci komplementu. Přítomnost J řetězce umožňuje IgM molekule vázat se na receptory na sekretorických buňkách, kterými je transportován do sekretů, které omývají mukózní povrchy.
Imunoglobulin A - tvoří 10-15% sérových Ig, ale zcela převládá v sekretech jako je mateřské mléko, sliny, slzy a hlen dýchacího, urogenitálního a trávicího traktu. Sekreční IgA je dimer nebo tetramer obsahující J řetězec a další polypeptidický řetězec nazvaný sekretorická komponenta. J řetězec je stejný jako u IgM a má stejnou funkci, sekretorická komponenta je produkována epiteliemi mukózních membrán. Za den se tvoří více sekrečního IgA než ostatních Ig tříd. Plazmatické buňky sekretující IgA jsou koncentrovány podél mukózních membrán. Sekretorickou komponentu zísává dimerický IgA během transportu přes mukózní epiteliální buňky do mukózního sekretu. IgA dimer se váže na receptor pro polymerický Ig na mukózních epiteliích, je endocytován a transportován přes buňku do lumen. Během tohoto procesu je receptor rozštěpen a jeho část získává imunoglobulin jako sekretorickou komponentu. Sekretorická komponenta chrání sekretorický IgA před proteolytickými enzymy v mukózních sekretech.
Imunoglobulin E - je v séru v extrémě nízké koncentraci 0,3 ug/ml.
 IgE protilátky zprostředkují reakce časného typu přecitlivělosti (astma, senná rýma). Prausnitz a Kustner (1921) injikovali sérum alergickího pacienta do kůže nealergického jedince. Když na stejné místo injikovali antigen (alergen), vyvinula se vyrážka (= první biologický test na IgE protilátky). IgE protilátky se vážou na Fc receptory na krevních bazofilech a tkáňových žírných buňkách. Jejich přemostění alergenem indukuje degranulaci bazofilů a žírných buněk a uvolnění farmakologicky aktivních mediátorů vede k alergické reakci. IgE protilátky mají též význam v protiparazitární imunitě.
Imunoglobulin D - byl poprvé objeven až u pacienta s příslušným myelomem. Tvoří jen O,2% serových Ig, jeho biologická funkce není dosud známa. Je spolu s IgM hlavním receptorem B buněk a funguje v jejich aktivaci antigenem.

Velká imunoglobulinová rodina (immuniglobulin superfamily)
Struktura imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců má určité rysy, naznačující společného evolučního předka. Je to hlavně typická doménová struktura imunoglobulinů ukazující na vývoj z jednoho primordiálního genu kódujícího peptid o asi 110 AK. Struktura b2mikroglobulinu, který je součástí MHC I molekul vykazuje homologii s konstantními doménami imunoglobulinových těžkých i lehkých řetězců. Podobně řada dalších membránových proteinů nese jednu nebo více oblastí homologních s imunoglobulinovými doménami. Je to T buněčný receptor, CD2, CD3, CD4 a CD8 molekuly, MHC I a MHC II, buněčné adhezivní molekuly, receptor pro polymerický IgA a IgM atd. Některé proteiny z této rodiny mají variabilní a konstantní domény homologní s imunoglobulinovými doménami. Protože většina členů této rodiny neváže antigen, musí být jiná příčina pro to , že mnoho odlišných proteinů má podobnou strukturu domén jako imuniglobuliny. Jednou z možností je to, že tato struktura je vhodná pro interakce mezi proteiny plasmatické membrány. Takovéto interakce existují na příklad meci CD4 a MHC II molekulami, CD8 a MHC I, nebo T receptorem a MHC molekulam