Přednáška IV

Interakce antigenu s protilátkou

  Síla vazby antigen-protilátka:
  Mezi  antigenem (Ag)  a protilátkou  (Ab) se  uplatňují nekovalentní   vazby zahrnující: vodíkové můstky, iontové vazby, hydrofobní vazby a   van  der  Waalsovy  síly (obr. 1).  Protože  jsou  tyto  vazby  slabé,  silná   interakce  Ag-Ab vyžaduje  velké množství  těchto vazeb.  Kromě toho   každá z těchto vazeb funguje na  velmi malou vzdálenost (méně než 1A   = 10-7 mm), takže silná  vazba je podmíněna vysokou komplementaritou   mezi Ag a Ab, s čímž souvisí vysoká specifita Ag-Ab interakce.

  Protilátková afinita:
  Suma jednotlivých nekovalentních interakcí mezi paratopem a epitopem   je  rovná afinitě  protilátky pro  daný epitop.  Protilátky s nízkou   afinitou slabě  váží Ag a  snadno disociují, zatím  co Ab s  vysokou   afinitou váží Ag silněji a déle.  Vazba mezi paratopem a epitopem na   monovalentním Ag může být popsána rovnicí
                               k1
               Ag + Ab       Ag-Ab
                               k-1
  kde  k1  je  asociační  rychlostní  konstanta  a  k-1  je disociační   rychlostní konstanta.  Poměr k1/k-1 je asociační  konstanta K, která   je  měřítkem  afinity.  Je  možno  ji  spočítat z poměru koncentrací   komplexu Ag-Ab ke koncentraci nenavázaného Ag a Ab
                           k1     (Ab-Ag)
                  K =  __    = _______
                           k-1    (Ab)(Ag)
  Ab s  nízkou afinitou pro  Ag mají hodnoty  K mezi 104  - 105 l/mol,   vysoce afinní Ab mohou mít hodnotu K až 1011 l/mol.

  Hodnota  K se  může stanovit  pomocí rovnovážné  dialýzy (obr. 2). Dialyzační   komůrka se  rozdělí semipermeabilní membránou,  která propustí pouze   Ag, nikoli Ab. Do  jedné části komůrky se dá Ab, do  druhé Ag. Ag se   radioaktivně označí a po ustavení rovnováhy se měří koncentrace Ag v   obou  částech  komůrky.  Koncentrace  volného  Ag  v obou částech je   stejná,  v  části  s  Ab  je  navíc  Ag  navázaný  na  Ab.  Rozdíl v   koncentraci  Ag  v  obou  částech  komůrky  vyjadřuje koncentraci Ag   vázaného na  Ab. Čím vyšší je  afinita Ab, tím více  Ag je vázáno na   Ab. Rovnovážná rovnice se může přepsat do tvaru
                        (Ab-Ag)                          r
                K = _______              =    _______
                        (Ab)(Ag)                   (n-r)(c)
  kde r = poměr koncentrace vázaného  Ag k celkové koncentraci Ab, c =   koncentrace  volného  Ag  a  n  =  počet  vazebných  míst v jedné Ab   molekule. Výraz může být přepsán do Scatchardovy rovnice
                    r
                   _    = Kn - Kr
                    c
  Hodnoty r a  c mohou být získány opakovanou  rovnovážnou dialýzou se   stejnou  koncentrací  Ab  a  různými  koncentracemi  Ag. Když se pak   vynese r/c proti r, směrnice získané  přímky je rovna -K. Toto platí   pro monoklonální  protilátku. V případě  polyklonálních Ab s  různou   afinitou je možno vypočítat průměrnou afinitu.

  Protilátková avidita:
  Když je  komplexní Ag nesoucí  mnoho epitopů smíchán  s protilátkami   nesoucími mnoho  paratopů, interakce Ab  s Ag na  jednom místě zvýší   pravděpodobnost  reakce na  dalším místě.  Síla takovéto  vazby mezi   multivalentní protilátkou  a antigenem je  nazývána avidita. Avidita   je používána  pro polyklonální antiséra na  rozdíl od monoklonálních   protilátek. Výsledná  avidita séra je mnohem  vyšší než pouhý součet   afinit jednotlivých protilátek v séru a rovná se jejich součinu.

  Skřížená reaktivita:
  Potilátka vyvolaná  jedním Ag může skříženě  reagovat s odlišným Ag.   K takovéto  skřížené reakci  dojde, jestliže  odlišné antigeny nesou   společný epitop,  nebo jestliže se  protilátky, specifické pro  jeden   epitop,  vážou na  jiný epitop  mající podobné  chemické vlastnosti.   V tomto případě je  vazebná afinita Ab pro původní  Ag vyšší než pro   tento  skříženě  reagující  epitop.  Skřížená  reaktivita  se  často   vyskytuje  mezi polysacharidovými  antigeny, které  obsahují podobné   oligosacharidové zbytky.
  Krevně  skupinové antigeny  (ABO) jsou  glykoproteiny exprimované na   červených krvinkách.  Jedinec, kterému chybí některý  z těchto Ag má   protilátky proti  tomuto chybějícímu Ag.  Jedinec s krevní  skupinou   A má Ab proti  B a naopak. Tyto Ab  jsou výsledkem expozice skříženě   reagujícím antigenům pocházejícím z  bakterií běžně se vyskytujících   ve střevech.
  Řada virů a bakterií má antigenní determinanty identické nebo podobné   s epitopy hostitelských buněk. Tyto Ag mohou vyvolat autoimunitní Ab   odpověď  poškozující  vlastní  tkáně.  Např.  Streptococcus pyogenes   obsahuje  ve své  buněčné stěně  proteinové M  antigeny, které mohou   skříženě reagovat  s antigeny srdečního  svalu a dalších  kosterních   svalů  a způsobovat  poškození  srdečního  svalu a  ledvin. Skřížená   reaktivita mezi kravskými neštovicemi  a variolou umožnila vakcinaci   proti variole.

  Precipitační reakce (obr. 4):
  Interakce   mezi  Ab   a  rozpustným   Ag  vytváří   síť,  která  je   stabilizována   hydrofobními   silami,   což   činí   Ab-Ag  komplex   nerozpustným. Protilátka musí být bivalentní,  Ag musí nést dvě nebo   více  kopií  téhož  epitopu.  Např  myoglobin  je dobře precipitován   polyklonálními séry ale ne monoklonální protilátkou protože obsahuje   mnoho  odlišných   Ag  determinant  pouze   s  jednou  kopií   každé   determinanty.
  Precipitace v roztoku:
  Kvantitativní  precipitační  reakce  se  provádí  ve  zkumavkách  do   kterých se  přidá konstantní množství Ab  a vzrůstající množství Ag.   Precipitát  se odcentrifuguje  a jeho  množství se  změří. Vynesením   množství  precipitátu proti  zvyšující  se  koncentraci Ag  se získá   precipitační křivka, která má vzestupnou část, sestupnou část a zónu   ekvivalence,  kdy je  optimální poměr  Ab:Ag. V  zóně nadbytku Ab se   tvoří  malé  rozpustné  komplexy   tvořené  několika  molekulami  Ab   vázajícími jednu  molekulu Ag. V  oblasti nadbytku Ag  se váže jedna   nebo  dvě molekuly  Ag k  jedné molekule  Ab a  síť se netvoří. Tato   metoda  se  někdy  používá  ve  formě  prstencového  testu,  kde  se   antisérum  v malé  zkumavce převrství  antigenem. Ag  i Ab difundují   proti sobě a v zóně ekvivalence se vytvoří prstencový precipitát.
  Precipitační reakce v gelech:
  Ag a Ab difundují proti sobě v agaru a v zóně ekvivalence se vytvoří   viditelný  precipitát. Imunodifuzní  technikou, kdy  Ag difunduje  z   jamky  do  agaru  obsahujícím  protilátku, je  možno  určit neznámou   koncentraci antigenu ze standardní  křivky získané vynesením průměrů   precipitačních kroužků  proti log příslušných  koncentrací antigenu.   Metoda se nazývá Manciniho jednoduchá radiální imunodifuse a rutinně   se    používá   ke    kvantifikaci   jednotlivých    tříd   sérových   imunoglobulinů, nebo složek  komplementu.  Citlivost  metody je 5-10   mg/ml.
  V Ouchterlonyho metodě  dvojité imunodifuse (obr. 5) Ag i  Ab difundují proti   sobě z jamek vyříznutých v  agaru a vytvářejí koncentrační gradient.   Tato jednoduchá technika umožňuje zjistit  vztah mezi antigeny i to,   kolik  Ab-Ag  systémů  je  přítomno.  Pokud  se  dva  Ag  umístí  do   sousedních  jamek  a  jsou  testovány  proti  jednomu  séru, získané   precipitační  linie umožní  zjistit,  zda  tyto Ag  sdílejí společný   epitop  (linie částečné  identity), jsou  identické (linie identity)   nebo zcela odlišné (linie nonidentity).
  Imunoelektroforéza (imunoelfo obr. 6)  kombinuje elektroforetickou separaci   s dvojitou imunodifuzí. Směs antigenů  je rozdělena elektroforézou v   agaru, pak jsou v agaru ve směru elektrického pole vyříznuty žlábky,   které jsou naplněny antisérem. Antigeny a protilátky difundují proti   sobě  a  vytvářejí  precipitační   linie.  Imunoelfo  je  užívána  v   laboratořích  k  detekci  přítomnosti  jednotlivých  proteinů v séru   (imunodeficience). Je to pouze kvalitativní technika.
  Raketová  elektroforéza (obr. 7) umožňuje  i  kvantifikaci  antigenu  až  do   koncentrace 20 ug/ml. Negativně nabitý Ag elektroforeticky migruje v   gelu obsahujícím Ab. Precipitát má tvar rakety, jejíž výška odpovídá   koncentraci   Ag.  Modifikace   raketové  elfo   nazvaná  dvousměrná   imunoelektroforéza,  umožňuje  kvantifikovat   několik  antigenů  ve   směsi.

  Aglutinační reakce:
  Interakce mezi protilátkou a  partikulárním antigenem vede ke vzniku   viditelných shluků - k  aglutinaci. Nadbytek Ab inhibuje aglutinační   reakci (efekt prozóny).
  Hemaglutinační  reakce je  rutinně prováděna  při stanovení krevních   skupin.  Při  neutrálním  pH  jsou  erytrocyty  obklopeny negativním   iontovým  mrakem,  takže  se  navzájem  odpuzují  (odpudivé  síly se   nazývají zeta potenciál). IgM může překonat zeta potenciál a vyvolat   hemaglutinaci.  IgG  je  mnohem  méně  efektivní.  Hemaglutinace  se   používá i při stanovení Rh fenotypu.
  Produkce  sérových  Ab  při   bakteriální  infekci  se  využívá  při   bakteriální aglutinaci. Aglutinační titr  je definován jako recipoká   hodnota  nejvyššího  ředění  séra,  které  ještě  vyvolá aglutinaci.   Aglutinační  rekce   slouží  nejen  při   diagnostice  bakteriálních   infekcí, ale i k serotypizaci bakterií.
  Pasivní hemaglutinace  je založena na  navázání antigenů na  červené   krvinky a jejich aglutinaci antisérem  proti tomuto Ag. K navazování   Ag  se  užívá  taninová  kyselina  nebo  chlorid  chromitý.  Pasivní   hemaglutinace je  daleko citlivější než  precipitační reakce a  může   detegovat Ab ještě v koncentraci 0,001 mg/ml.
  Inhibice  aglutinace  je  velmi  citlivá  metoda, umožňující detekci   malých množství antigenu. Ag je  navázán např. na latexové partikule   a v testu je přítomná protilátka  proti tomuto Ag, která aglutinuje.   Přítomnost  totožného Ag  ve zkoumaném  vzorku inhibuje  aglutinaci,   protože tento Ag obsadí vazebná místa  Ab. Tento test se používá i k   průkazu  užívání  drog  (kokain,  heroin).  Některé  viry  spontánně   hemaglutinují a  proto inhibice hemaglutinace  sérovými protilátkami   může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).

  Radioimunoassay (RIA  obr. 8):
  RIA je  vysoce citlivá technika schopná  prokázat pikogramy (10-12g)   antigenu  nebo  protilátky.  Rosalyn  Yalow  dostala  za  vývoj této   techniky  v roce  1977 Nobelovu  cenu. Principem  je soutěžení  mezi   radioaktivně značeným Ag a neznačenýn Ag o vazbu s vysoce afinní Ab.   Značí se  obvykle 125I (gama zářič)  a značený Ag je  smíchán s Ab v   takové koncentraci, že právě saturuje  vazebná místa na Ab molekule.   Přidání neznačeného Ag vede k vytěsnění  značeného Ag z vazby na Ab,   které  je  úměrné  koncentraci  neznačeného  Ag.  Měření  uvolněného   značeného Ag umožňuje určit koncentraci neznačeného Ag. Protilátka s   navázaným Ag je vyprecipitována z roztoku anti-izotypovým sérem nebo   proteinem  A  ze  Staphylococcus  aureus.  Některé  metody využívají   navázání Ab  na pevnou fázi,  což mohou být  sefarózové kuličky nebo   mikrotitrační  destička. Tato  metoda byla  použita např.  k detekci   viru  sérové  hepatitidy  B,  což  mělo  velký  význam  pro vyřazení   infikovaných dárců krve.

  Imunoenzymatická metoda:
  Enzyme-linked  immunosorbent assay  (ELISA) je  založena na podobném   principu  jako  RIA  a  má  srovnatelnou  citlivost.  Místo  značení   radioizotopem se užívá navázání  enzymu na protilátku. Reakce enzymu   s bezbarvým substrátem vede k barevnému produktu, jehož množství lze   spektrofotometricky měřit. Používají se enzymy peroxidáza, alkalická   fosfatáza  a  další.  Existují  různé  typy  ELISA  testů, kdy je na   destičku navázán Ag  nebo Ab a které se  liší počtem dalších vrstev.   Nepřímá  ELISA  s  vrstvami  Ag, sérová  Ab,  antiizotypová Ab značená   peroxidázou se užívá k průkazu sérových protilátek proti HIV.

  Western blotting (obr. 9):
  Slouží k identifikaci specifického  proteinu ve směsi proteinů, nebo   protilátky  k   danému  proteinu.  V   této  metodě  jsou   proteiny   elektroforeticky separovány v  polyakrylamidovém gelu za přítomnosti   dodecylsulfátu  sodného.  Proteinové  proužky  jsou elektroforeticky   přeneseny  na nitrocelulózovou  membránu a  jednotlivé proteiny jsou   identifikovány protilátkou značenou izotopem nebo enzymem.

  Imunofluorescence:
  Vazba Ab na Ag  je vizualizavána označením protilátky fluorochromem.  Nejčastěji užívanými  fluorochromy jsou fluorescein  a rhodamin. Oba   mohou být konjugovány s Fc  oblastí protilátkové molekuly aniž dojde   k poškození  antigen-vazebné kapacity.  Tyto fluorochromy  absorbují   světlo určité  vlnové délky a  emitují světlo o  vyšší vlnové délce.   Např  fluorescein   absorbuje  modré  světlo  (490   nm)  a  emituje   žlutozelené  (517 nm).  K hodnocení  testu se  užívají fluorescenční   mikroskopy   se   zdrojem   UV    záření   a   excitačními   filtry.   Imunofluorescence se  používá ke studiu buněčných  antigenů. V přímé  metodě  je  je  fluorochromem  značena  Ab  proti  sledovanému Ag, v   nepřímé  se  k  vizualizaci  této  Ab  používá značené antiizotypové   protilátky  nebo značeného  proteinu A,  nebo je  jedna z protilátek   konjugována  s biotinem  a k  jejímu průkazu  se užije  streptavidin   konjugovaný s fluorochromem. Nepřímá metoda je citlivější než přímá.
  Subpopulace   lymfocytů   označené   protilátkami   konjugovanými  s   fluorochromy  mohou být  analyzovány a  děleny na  základě intenzity   fluorescence.    K    separaci    buněk se    používá    přístroj   fluorescence-activated  cell  sorter  (FACS),  který vychyluje buňky   s laserem excitovaným fluorochromem v elektrickém poli (obr. 10).

  Imunoelektronová mikroskopie:
  Protilátky    k    buněčným     komponentám    jsou    vizualizovány   elektron-densními  značkami  -   feritinem  nebo  koloidním  zlatem.   Protože  tyto značky  absorbují elektrony  jeví se  jako malé  černé   tečky.  Při  značení  koloidním  zlatem  mohou  být různé Ab značeny   zlatými partikulemi různé velikosti, což umožňuje jejich odlišení na   snímku.

                  

Hybridomy a monoklonální protilátky

  Kohler  a Milstein  (1975) -  fúzovali normální  plasmatické buňky s   myelomovými  buňkami  a  získali  hybridní  buňky (hybridomy), které   získaly nesmrtelnost od myelomových  buněk a schopnost produkovat Ab   od plasmatických buněk.
  Fúze  dvou buněk  lze dosáhnout  působením viru  Sendai nebo častěji   polyetylénglykolu,  agens, která  podporují fúzi  buněčných membrán (obr. 11).   Vznikne mnohojaderný  heterokaryon, jehož jaderné  membrány postupně   splynou a  jedno velké jádro obsahuje  chromozomy obou rodičů. Běhen   dělení této  hybridní buňky dochází  k náhodným ztrátám  chromozomů,   dokud  se  buňka  nestabilizuje.  Pokud  dojde  ke ztrátě chromozomu   potřebného pro  přežití, buňka hyne.  Hybridomy z myších  a lidských   buněk   postupně  ztratí   všechny  lidské   chromozomy.  K  selekci   hybridomových  buněk  na  úkor  rodičovských  se  používá selektivní   medium  obsahující hypoxantin,  aminopterin a  thymidin (HAT). Savčí   buňky  mají dvě  dráhy pro  syntézu nukleotidů  - hlavní a náhradní.   Když  je  hlavní  dráha  blokována  aminopterinem, analogem kyseliny   listové,  buňky   využívají  náhradní  dráhu   katalyzovanou  enzymy   hypoxantin-guanin  fosforibozyl  transferázou   (HGPRT)  a  thymidin   kinázou. Mutace  v kterémkoli z těchto  enzymů blokuje tuto náhradní   dráhu. HAT  medium obsahuje aminopterin  k zablokování hlavní  dráhy   a hypoxantin  a  thymidin  pro  náhradní  dráhu.  Pokud  jsou k fúzi   použity myelomové buňky  s mutací v HGPRT, v  HAT mediu rostou pouze   hybridomové  buňky,  protože  využívají  náhradní  dráhu získanou od   B lymfocytů. Samotné lymfocyty pouze přežívají nekolik dnů, in vitro   se nedělí.

  Produkce monoklonálních protilátek:
  Skládá se ze  tří základních kroků: (1) konstrukce  B hybridomů, (2)   testování   získaných  klonů   na  produkci   protilátky  požadované   specifity a (3) pomnožení vybraných hybridomů.
  Zfúzované buňky  se nasazují do jamek  mikrotitračních panelů s tzv.   feeder  buňkami,  což  jsou  nejčastěji  peritoneální makrofágy nebo   thymocyty. Po  5-10 dnech růstu  v HAT mediu  jsou viditelné kolonie   hybridomových  buněk,  každá   představuje  klonální  expanzi  jedné   hybridomové buňky.
  K testování  hybridomů  na  produkci  požadovaných  Ab se nejčastěji   užívá technik jako je ELISA (obr. 12) a RIA, které umožňují současné vyšetření   velkého počtu vzorků. Úspěšně bývá využita i imunofluorescence.
  Pozitivní hybridomy se dále klonují metodou limitního ředění, kdy se   buňky naředí tak, aby na  jednu jamku mikropanelu připadla asi jedna   buňka.  Získají se  tak  klony  buněk představující  potomstvo jedné   buňky a produkující monoklonální protilátky.
  Monoklonální protilátky  (MAbs) mohou být  pak produkovány in  vitro   kultivací hybridomových  buněk v mediu (výtěžek  MAbs 10-100 mg/ml),   nebo v  peritoneu syngenních myší  jako ascitické tekutiny  (výtěžek   MAbs  1-25   mg/ml).  MAbs  se   z  ascitickí  tekutiny   purifikují   chromatografií.

  Produkce lidských monoklonálních protilátek:
  Problémem užití  myších MAbs u  lidí je antiizotypová  reakce, která   může vést až k alergickým komplikacím. Problémy se získáním lidských   MAbs  spočívají  v  imunizaci  (pouze  in  vitro) a absenci vhodných   myelomových buněk.
  Alternativní cesta je přes infekci B buněk virem Epsteina a Barrové,   čímž  tyto  buňky  získají  vlastnosti  nádorových  buněk  a  přitom   sekretují požadovanou protilátku. Klonováním těchto transformovaných   buněk je možno získat lidské MAbs.

  Použití monoklonálních protilátek:
  Purifikace proteinů:
  Místo opakovaných  chromatografií s nízkým výtěžkem  je možno využít   imunosorbentů,  kde  je  MAb  navázána  na  nějaký nosič (sefarózové   kuličky)  a specificky  vychytává antigen  ze směsi.  Použití takové   imunosorbentní  kolony  k  vyčištění  hrubého  preparátu interferonu   vedlo k 5000násobnému zvýšení čistoty.

  Identifikace a izolace lymfocytárních subpopulací a klonů:
  Protože subpopulace lymfocytů nebo jejich různá diferenciační stadia   nesou na povrchu charakteristické antigeny, mohou být MAbs využity k   jejich  rozlišení (např.  separace CD4+  a CD8+  buněk pomocí FACS).   Určitá  subpopulace může  být ze  směsi odstraněna  působením MAb  a   komplementu.  Klonotypické  MAbs  rozpoznávají  membránové  proteiny   jedinečné pro určitý lymfocytární klon.

  Identifikace nádorových buněk:
  Nádorové  buňky  nesou  specifické  antigeny,  které  je odlišují od   netransformovaných  buněk.  MAbs   proti  těmto  antigenům  umožňují   detekci tumorů, např. metastáz ve  velmi časném stadiu. Problémem je   však to, že řada tumorů nenese společný specifický antigen.

  Likvidace nádorových buněk:
  MAbs společně  s komplementem mohou  zabíjet nádorové buňky.  Pomocí   velkých  dávek  specifických  MAbs  se  podařilo  vyléčit pacienta s   metastázovaným  B  lymfomem.  V  případě,  že  jsou  nádorové  buňky   rezistentní k lýze zprostředkované komplementem, nádorově specifická   MAb se  konjuguje s radioizotopem nebo  toxinem a vzniklý imunotoxin   je  může  rozpoznat  a  zabít (obr. 13).  Užívají  se  ricin, Shigella toxin a   difterický toxin.  Každý z těchto  toxinů sestává ze  dvou nebo více   polypeptidových komponent - ze samotného  toxinu a ligandy, která se   váže na buněčný receptor. Tento  vazebný polypeptid je u imunotoxinu   zaměněn   za   protilátkovou   molekulu   specificky  rozpoznávající   nádorovou buňku.

  Diagnostické reagencie:
  Existují  stovky MAbs  usnadňujících diagnostiku  infekčních chorob,   monitorování terapeutických léků, detekci diabetu, tumorových buněk,   průkaz těhotenství, mapování HLA antigenů atd.

  Modifikace    monoklonálních     protilátek    užitím    technologie   rekombinantní DNA:
  Chimerické monoklonální protilátky:
  Připraví  se rekombinantní  DNA obsahující  promotor a  sekvence pro   variabilní oblast  protilátky z myšího  protilátkového genu a  exony   kódující konstantní oblast z  genu pro lidskou protilátku. Antigenní   specifita   odpovídá  myší   protilátce,  izotyp   je  lidský.  Tyto   chimerické  protilátky jsou  méně imunogenní,  pokud jsou injikovány   lidem. Byly připraveny i chimerické  MAbs obsahující pouze myší CDR,   v lidské protilátkové molekule.
  Lze  také  připravit  heterokonjugáty  jako  hybridy  dvou odlišných   protilátkových molekul. Polovina  protilátkové molekuly má specifitu   pro  nádorovou  buňku,  druhá  polovina  pro  povrchovou molekulu na   imunní   efektorové  buňce   (NK  buňka,   aktivovaný  makrofág,  Tc   lymfocyt).  Tyto  heterokonjugáty  slouží  k přemostění efektorových   a tumorových buněk.

  Příprava  monoklonálních  protilátek  z  imunoglobulinových genových   knihoven:
  Nová  technologie   přípravy  MAbs  bez  hybridomů   a  dokonce  bez   imunizace.  K amplifikaci  DNA kódující  lehké a  těžké řetězce  Fab   fragmentů z  hybridomových nebo plazmatických buněk  se použije PCR.   Knihovny lehkých a těžkých  řetězců jsou konstruovány v bakteriofágu   lambda.  Pomocí restrikčního  enzymu EcoRI  jsou připraveny  náhodné   kombinace  lehkých a  těžkých řetězců.  Tento postup  vede ke vzniku   obrovské diverzity  protilátkových kombinací. Klony  obsahující tyto   náhodné kombinace se pak testují na specifitu pro vybraný antigen.

  Katalytické monoklonální protilátky (abzymy):
  Vazba protilátky  na antigen je  v mnoha směrech  podobná jako vazba   enzymu na substrát. Enzym využívá své vazebné energie ke stabilizaci   tranzičního  stavu   substrátu  a  tak   snižuje  aktivační  energii   potřebnou  pro chemickou  modifikaci substrátu.  Proto byl připraven   komplex  hapten-nosič,  ve  kterém  hapten  strukturálně napodoboval   tranziční   stav   esteru,   podléhajícího   hydrolýze.   Když  byly   anti-haptenové  MAbs  inkubovány   s  esterem,  některé  urychlovaly   hydrolýzu  až  1000x.  Katalytická  aktivita  těchto protilátek byla   vysoce  specifická. Tyto  protilátky byly  nazvány abzymy.  Produkce   velkého množství monoklonálních protilátek pomocí imunoglobulinových   genových  knihoven   umožnila  získání  řady   MAbs  s  katalytickou   aktivitou.  Předpokládá  se,  že  tímto  způsobem  se  může  podařit   připravit baterie  abzymů, které budou  štípat peptidové řetězce  ve   specifických místech podobně jako restrikční enzymy.

  T hybridomy:
  Jsou připravovány fúzí stimulovaných T  buněk s nádorovými T buňkami   (thymomové buňky)  podobně jako B  hybridomy. T hybridomy  sekretují   interleukíny nebo mají cytotoxickou aktivitu. Konstrukce T hybridomů   přispěla  k  poznání  struktury  a  funkce  interleukinů, T receptorů   a dalších T-specifických molekul.