Organizace a exprese imunoglobulinových genů

Sekvence B lymfocytové maturace a antigenem indukované diferenciace jsou na obr. č. 1.Genetický model odpovídající imunoglobulinové struktuře musí vysvětlovat následující skutečnosti:
a)	obrovskou diverzitu protilátkových specifit (asi 108 specifit)
b)	přítomnost variabilní oblasti na N konci a konstantní oblasti na C konci těžkých a lehkých řetězců
c)	přítomnost různých izotypů se stejnou antigenní specifitou.

Existovaly dvě teorie na uspořádání imunoglobulinových genů:
Podle germinální reorie genom obsahuje velký repertoár Ig genů dostatečný pro tvorbu 108 Ab specifit.
Podle somatické variační teorie obsahuje genom relativně malé množství Ig genů z nichž se velký počet Ab specifit vytváří v somatických buňkách mutačními nebo rekombinačními mechanismy.
V roce 1965 Dryer a Bennett předložili model, podle kterého každý těžký nebo lehký řetězec kódují dva oddělené geny, z nichž jeden kóduje variabilní a druhý konstantní část. Tyto dva geny se pak spojují na úrovni DNA, aby vytvořili informaci, která je dále přepsána a vede k syntéze lehkých a těžkých proteinových řetězců. Podle této teorie obsahuje germinální linie stovky tisíc genů kódujících V oblast, ale pouze několik genů pro C oblast. Spojení V a C oblastí se uskutečňuje na úrovni DNA. Představa dvou genů kódujících jeden polypeptid neodpovídala všeobecně přijímanému principu jeden gen - jeden polypeptid. Vývoj nových technik (m-RNA purifikace, restrikční endonukleázy, hybridizace nukleových kyselin, Southern blotting, klonování a sekvenování DNA, transfekce a transgeneze) potvrdil tuto teorii.
První potvrzení hypotézy Dryera a Bennetta poskytly pokusy Tonegawy a Hozumiho (1976). Fragmenty DNA z embryonálních a myelomových buněk rozdělili elektroforézou a hybridizovali s radioaktivní m-RNA pro kapa řetězec. Zatím co 2 restrikční fragmenty z embryonální DNA hybridizovaly s m-RNA sondou, u myelomové DNA hybridizoval pouze jeden fragment. Z toho vyplývá, že v embryonálních buňkách jsou V a C geny vzdálené a oblast mezi nimi obsahuje restrikční místo. V plazmatických buňkách je DNA přeskupena tak, že V a C úseky jsou blíže.
Kapa a lambda řetězce a těžké řetězce jsou kódovány oddělenými multigenními rodinami umístěnými na odlišných chromozomech (např. u člověka je gen pro lambda řetězec na chromozomu 22, pro kapa řetězec na chr. 2 a pro těžké řetězce na chr. 14). Každá z těchto rodin obsahuje skupinu kódujících sekvencí nazvaných genové segmenty. Kapa a lambda rodiny obsahují genové segmenty L,V,J a C, rodina těžkých řetězců obsahuje segmenty L,V,D,J a C. Funkční Ig geny se vytvářejí během maturace B buněk v procesu, kde se genové segmenty přeskupují a dostávají se k sobě. Genový segment L kóduje krátký signální nebo uváděcí (leader) peptid, který vede těžké a lehké řetězce endoplazmatickým retikulem a před složením Ig molekuly je odštípnut.

Multigenová rodina lambda řetězce (obr. 2):
Gen pro variabilní oblast obsahuje dva kódující segmenty V a J, které jsou v germinální DNA odděleny. Multigenová rodina obsahuje 2 V segmenty, 4 J segmenty a 4 C segmenty. Segmenty J4 a C4 jsou defektní pseudogeny. V a J segmenty kódují variabilní oblast, C segmenty kódují konstantní oblasti tří subtypů lambda řetězců.

Multigenová rodina kapa řetězce (obr. 2):
Obsahuje asi 300 V genových segmentů, každý má svou leader sekvenci. Dále je zde 5 J segmentů (jeden z nich je nefunkční pseudogen) a jeden C segment.

Multigenová rodina těžkých řetězců (obr. 2):
Obsahuje 300-1000 V genových segmentů, dále asi 12 D segmentů (tento segment kóduje aminokyseliny v CDR3 a protože se výrazně podílí na diverzitě Ab molekul, byl označen D), 4 J segmenty a skupinu C genových segmentů. Každý C segment kóduje konstantní oblast určitého izotypu. Genové segmenty konstantní části těžkých řetězců obsahují skupiny exonů a intronů, každý exon kóduje jednu doménu těžkého řetězce. CH genové segmenty jsou uspořádány v pořadí Cm -Cd -Cg3-Cg1-Cg2b-Cg2a-Ce -Ca . Toto pořadí není náhodné a odpovídá postupnému výskytu Ig tříd během imunitní odpovědi.

Přeskupení genů variabilní oblasti:
Uskutečňuje se během zrání B buněk v kostní dřeni. Nejdříve se přeskupují geny variabilní oblasti těžkých řetězců, pak geny pro variabilní oblast lehkých řetězců. V této době už je dána antigenní specifita příslušné B buňky. K přeskupení genů pro konstantní oblast těžkých řetězců dochází později bez vlivu na Ag specifitu protilátky. Ikdyž k přeskupování genů pro variabilní oblast dochází v předem určeném pořadí, dochází k náhodným jevům, jejichž výsledkem je náhodné určení Ab specifity.

V-J přeskupení v DNA pro lehké řetězce (obr. 3): Během přeskupování lambda genových segmentů se může V1 genový segment spojit s J1 nebo J3, nebo V2 segment s J2 segmentem. V případě kapa řetězce se může libovolný z 300 V genových segmentů spojit s jedním ze 4 funkčních J segmentů. Přeskupené geny pro lambda a kapa řetězce obsahují krátký L segment, pak intron, dále spojené VJ segmenty, zase intron a nakonec C segment. Nad L segmentem je promotorová sekvence. Přepisem sekvence pro lehký řetězec vzniká primární RNA transkript, z něhož jsou následně odstraněny introny a m-RNA pak opouští jádro, váže se na polyribozomy a je přeložena do proteinové struktury lehkého řetězce (obr. 4).

V-D-J přeskupení v DNA pro těžké řetězce (obr. 5): Vytvoření funkčního genu pro těžký řetězec vyžaduje dvojí přeskupení ve variabilní oblasti. D segment se nejdříve připojí k J segmentu, vzniklý DJ segment se pak přiblíží k V segmentu a spojí se s ním. Struktura přeskupeného genu kódujícího VH oblast zahrnuje L segment, intron, VDJ segment, další intron a skupinu C genových segmentů.
Nejdříve se přepisují jak Cm, tak Cd genové segmenty. Při enzymatickém zpracování primárního transkriptu jsou odstraněny introny a vznikají dvě m-RNA kódující buďto Cm nebo Cd. Protože jsou v jedné buňce produkovány dvě odlišné m-RNA pro těžké řetězce, imunokompetentní B buňka exprimuje na svém povrchu IgM a IgD s identickou Ag specifitou.

Mechanismus přeskupování DNA pro variabilní oblast: Byly objeveny rekombinační signální sekvence (RSS) na okrajích germinálních V, D a J genových segmentů. Každá RSS obsahuje konzervovanou heptamerickou a nonamerickou (bohatou na AT) sekvenci. Tyto sekvence byly nalezeny na obou stranách D segmentů, na 3, straně V segmentů a 5, straně J segmentů. Nonamerické a heptamerické sekvence jsou odděleny sekvencí nazvanou spacer, která má konzervovanou pouze délku - 12 nebo 23 párů bazí. Je zajímavé, že RSS mající spacer o 12 párech bazí se může spojit pouze se sekvencí obsahující 23 párový spacer. Toto tzv 12/23 spojovací pravidlo zajišťuje, že se VL segmenty spojí pouze s JL segmenty a ne s jiným VL segmentem a že VH, DH a JH segmenty se spojí ve správném pořadí. 

Spojování genových segmentů (obr. 6):
Existují dva typy spojování - deleční a inverzní. Při obou typech spojování se vytvoří klička DNA, ve které se rekombinační signální sekvence dostávají do blízkosti. V případě delečního typu spojování enzym rekombináza rozpozná strukturu kličky, vystřihne ji a spojí V a J segmenty. Když jsou transkripční orientace V a J segmentů opačné, vytvoření kličky zahrnuje inverzi a orientuje oba segmenty do stejného směru transkripce (5,- 3,). V tomto případě nedojde k deleci.
Spojování V-D-J segmentů je do jisté míry flexibilní (obr. 7) v tom smyslu, že do přeskupené sekvence mohou přijít jeden nebo dva nukleotidy místo tří. Potom není zachována tripletová čtecí kostra a vytvoří se stop kodony, což vede k tomu, že toto přeskupení je neproduktivní. Neproduktivní přeskupení se vyskytuje s vysokou frekvencí. Na druhé straně flexibilita přeskupování přispívá k vytváření diversity protilátkových specifit. Pokud se jedna alela přeskupí neproduktivně, buňka přeskupí druhou alelu. Produktivní přeskupení V-D-J segmentů těžkého řetězce je podmínkou pro přeskupení V-J segmentů lehkých řetězců. Kapa řetězec se přeskupuje první. Pokud je toto přeskupení neproduktivní pro obě alely, přeskupují se geny pro lambda řetězce. Pokud jsou obě přeskupení neproduktivní, B buňka přestane zrát.

Vyloučení alel (allelic exclusion):
B buňky jsou diploidní a obsahují mateřské i otcovské chromozomy. B buňky však exprimují přeskupené geny pro těžké řetězce pouze z jednoho chromozomu. Totéž platí pro lehké řetězce. To zaručuje, že funkční B buňka nikdy neobsahuje víc než jednu VHDHJH a jednu VLJL sekvenci. To znamená, že po jednom produktivním přeskupení genů pro těžké a lehké řetězce se enzymy zodpovědné za přeskupování vypnou a k dalšímu přeskupování nedojde. Jako signál k zastavení dalšího překupování zřejmě funguje exprimovaný protein kódovaný již přeskupenou DNA.

Jako jiné promotory, Ig promotory obsahují vysoce konzervovanou sekvenci bohatou na AT, nazvanou TATA box, ke které se váže RNA polymeráza II. Po V-D-J a V-J přeskupení se zvyšuje rychlost transkripce. Je to způsobeno vlivem enhanceru, což je DNA sekvence působící v cis a nějakým způsobem usnadňující vytvoření iniciačního komplexu pro transkripci v místě promotoru. Během přeskupování se promotor dostává do blízkosti enhanceru což zvyšuje rychlost transkripce příslušných sekvencí 10.000x.

Přeskupení DNA umožňující přesmyk imunoglobulinových tříd:
Po antigenní stimulaci B buňky může dojít k dalšímu přeskupení DNA pro těžké řetězce, při kterém se VHDHJH sekvence může spojit s kterýmkoli z CH genových segmentů. Tohoto procesu se zřejmě účastní tzv. přesmyková místa (switch sites) lokalizovaná před jednotlivými CH segmenty. Předpokládá se, že na tato místa se mohou vázat rekombinázové proteiny specifické pro jednotlivé Ig třídy a tak usnadňovat rekombinaci DNA. Přesmyk Ig třídy může být indukován některými cytokíny (např IL-4 indukuje přesmyk z Cm na Cg1 nebo Ce ). Přesmyk je provázen delecí sekvencí kódujících předcházející typy C řetězců, které byly prokázány v cirkulární formě.

Exprese imunoglobulinových genů:
K produkci funkční m-RNA je třeba enzymatické zpracování primárního transkriptu. Po navázání 7-metylguanosinu na 5, konci a polyadenylaci 3, konce dojde k excisi intronů v procesu nazvaném RNA splicing. m-RNA je pak exportována z jádra a dochází k její translaci na polyribozomech.
Odlišné zpracování primárních transkriptů pro těžké řetězce vysvětluje produkci na membránu vázané a sekretované formy imunoglobulnů i současnou expresi IgM a IgD.
Sekvenování C genového segmentu ukázalo, že Cm4 exon obsahuje na svém 3, konci sekvence kódující hydrofilní sekvence CH4 domény sekretovaného IgM. Za tímto exonem jsou však další dva exony M1 a M2, které kódují transmembránový a cytoplasmatický segment C 4 domény u IgM vázaného na buněčnou membránu (obr. 8). Primární transkript obsahuje všechny exony C segmentu včetně M1 a M2. Produkce sekretované nebo membránové formy imunoglobulinu závisí na zpracování společného primárního transkriptu. Čili jestli dojde k odštěpení M1 a M2 exonů, nebo zůstanou součástí m-RNA.
Podobně je tomu u současné exprese IgM a IgD (obr. 9). Transkripce přeskupených genů pro těžké řetězce ve zralých B buňkách produkuje primární transkripty obsahující Cm i Cd genové segmenty. Čili primární transkript VDJCmCd je zpracován dvěma cestami za vzniku VDJCm a VDJCd .
m-RNA pro lehké a těžké řetězce jsou překládány na odlišných polyribozomech endoplazmatického retikula (obr. 10). Nově syntetizované řetězce obsahují signální (leader) sekvenci, která vede řetězec do lumen ER a je potom odstřižena. Ke spojení lehkých a těžkých řetězců a jejich glykosylaci dochází když řetězce procházejí přes cisterny ER do Golgiho aparátu a pak do sekrečních váčků, které fúzují s plazmatickou membránou. V případě IgM se H a L řetězce spojují v ER a tvoří poloviční molekuly, které se potom spojují do kompletní molekuly. U IgG se nejdříve spojují těžké řetězce a k nim se pak připojí lehké.

Diferenciace B buněk v souvislosti s přeskupením genů a alternativním zpracováním RNA (obr. 11):
Ke zrání B buněk dochází ve dvou fázích, z nichž první je nezávislá na antigenu, druhá je antigen-dependentní. V první fázi kmenová buňka diferencuje na progenitorovou B buňku a pak na zralou imunokompetentní B buňku. Během této fáze dochází k přeskupení VH a VL genových segmentů. Zralá B buňka opouštějící kostní dřeň má na membránu vázané imunoglobuliny jedné Ag specifity. Jestliže se zralá B buňka setká s Ag, dojde k její klonální expanzi za vzniku plazamatických a paměťových buněk.
Nejnezralejší odlišitelná B buňka - progenitorová B buňka exprimuje specifický antigen B220. V tomto stadiu dochází k přeskupení DH-JH. V dalším stadiu dojde k přeskupení VH-DH-JH a vzniku pre-B buňky. V tomto stadiu se uskutečňuje vyloučení alel. Gen pro těžký řetězec je přepsán do primárního transkriptu obsahujícího VHDHJHCmCd . Diferenciální zpracování tohoto primárního transkriptu produkuje m-RNA, která kóduje membránovou formu těžkého řetězce. Pak dojde k přeskupení VL-JL a vzniká nezralá B buňka. Přeskupování začíná na kapa segmentu, pokud je neproduktivní, přesune se na lambda segment. Další diferenciace nezralých B buněk vede k koexpresi IgD a IgM na membráně, což charakterizuje zralé B buňky.
Po setkání s Ag dochází ke klonální selekci a dalšímu zrání B buněk na plazmatické a paměťové buňky. Paměťové buňky mohou prodělat přesmyk vedoucí k expresi nového izotypu na membráně (t.j. IgG, IgA nebo IgE). Některé paměťové buňky exprimují jeden izotyp, zatímco jíné dva (jeden z nich je vždy IgM).
Plazmatické buňky nemají membránový Ig ale sekretují velké množství Ab molekul.

Vznik protilátkové diverzity (obr. 12):
DNA germinální linie obsahuje asi 300 V kapa genových segmentů, 300-1000 VH segmentů, ale pouze dva V lambda genové segmenty. K diverzitě přispívají i JL DH a JH segmenty, které se vyskytují v několika formách. K další diverzifikaci dochází kombinováním segmentů při přeskupování. 300-1000 VH segmentů kombinuje s 12 DH segmenty a 4 JH segmenty, t.j. 300x12x4=1,4x104 kombinací. Podobně 300 V kapa genových segmentů kombinuje se 4 J kapa segmenty což vede k 1,2x103 možným kombinacím.
 Protože specifita Ab pro Ag je určena variabilními oblastmi H i L řetězců, další diverzita vzniká kombinací H a L řatězců. 1,4x104 x 1,2x103 = 1,7x107 možných kombinací kapa řetězce s těžkými řetězci.
Tato diverzita je dále zvýšena díky flexibilitě procesu spojování. Idkyž tato flexibilita vede k mnoha neproduktivním přeskupením, zvyšuje Ab diverzitu vznikem produktivních kombinací kódujících alternativní aminokyseliny v místě spojení. Tato místa se nacházejí v třetí hypervariabilní oblasti (CDR3), z čehož vyplývá velký vliv těchto AK záměn na Ab diverzitu. V průměru vytváří tato flexibilita 3 různé AK na kždé spojovací místo. Protože tato místa jsou dvě pro těžké řetězce, je diverzita H řetězců takto zvýšena 9x, zatímco u lehkých řetězců pouze 3x. Flexibilita spojování tedy zvyšuje celkový počet kombinací pro H řetězce 1,4x104x3x3=1,3x105 a pro lehké kapa řetězce 1,2x103x3=3,6x103.
Hranice mezi spojenými V-D a D-J segmenty obsahuje tzv. N-oblasti, kam jsou během spojování genových segmentů náhodně připojovány nukleotidy deoxynukleotidyl transferázou. Takto vytvořená diverzita je dosti značná, protože N-oblasti obsahují zcela náhodné sekvence a jsou lokalizovány v CDR3 těžkých řetězců.
 Další diverzita se vytváří v přeskupených variabilních oblastech somatickými mutacemi, kdy jsou jednotlivé nukleotidy nahrazovány alternativními bázemi. Porovnání variabilních oblastí germinální DNA s těmito oblastmi u somatických buněk prokázalo somatické mutace v genech pro L i H řetězce. Odhadnutá frekvence somatických mutací v imunoglobulinových genech je 10-3 mutací/pár bazí/buněčné dělení, což je 106x více než v jiných genech, což ukazuje na predispozici B buněk k somatickým mutacím.
Je zajímavé, že během vývoje imunitní odpovědi od primární přes sekundární k terciární atd. se zvyšuje afinita protilátek. Ikdyž je proces somatických mutací náhodný a může produkovat Ab s vyšší nebo nižší afinitou, schopnost antigenu řídit klonální expanzi selektivně zvyšuje proliferaci B buněk s vysoce afinními receptory na povrchu.