Cytokiny

Cytokiny jsou sekretovány různými buňkami zahrnutými v imunitní odpovědi a působí na cílové buňky nesoucí receptory pro danný cytokin. Jednotlivé cytokiny mohou působit autokrinně na stejnou buňku, která je sekretovala, nebo parakrinně na sousední buňky, nebo endokrinně a pak se váží na vzdálené buňky. Vazba cytokinu na buněčný receptor přenáší signál do buňky a vede k aktivaci a expresi genů. Cytokiny regulují intenzitu a trvání imunitní odpovědi stimulací a inhibicí proliferace různých buněk nebo sekrece Ab nebo jiných cytokinů těmito buňkami.
Působení cytokinů je pleiotropní, to znamená, že vyvolávají různé biologické aktivity u různých cílových buněk. Jsou také redundantní v tom, že různé cytokiny mohou mít podobnou funkci, což ztěžuje popis funkce jednotlivých cytokinů. Dva cytokiny mohou působit synergicky, což značí, že jejich společný účinek je větší, než součet účinků jednotlivých cytokinů. Jindy vykazují antagonismus, kdy účinek jednoho cytokinu inhibuje účinek jiného. Účinek jednoho cytokinu na buňku obvykle reguluje expresi cytokinového receptoru a expresi dalších cytokinů, které působí na jiné buňky. Např. cytokiny produkované aktivovanými TH buňkami mohou ovlivňovat aktivitu B buněk, TC buněk, NK buněk, makrofágů, granulocatů, hemopoetických kmenových buněk a tím aktivovat celou síť interagujících buněk.
Určitá nespecifita (ve srovnání se specifitou protilátek či T recptorů) v působení cytokinů je nahrazena přísnou regulací exprese cytokinových receptorů na buňkách. Často jsou tyto receptory exprimovány na buňce až po její interakci s Ag. Tím je nespecifická lymfokinová aktivace omezena na lymfocyty, které se setkaly s Ag. Jiným mechanismem udržujícím specifitu je požadavek na vzájemný kontakt buněk, aby se vytvořily účinné koncentrace cytokinu.

K poznání struktury a funkce cytokinů přispělo objevení nádorových buněk sekretujících cytokiny. To poskytlo možnost získat homogenní populace buněk, sekretujících cytokiny ve větším množství, než kultury lymfoidních buněk. Dalším pokrokem byl objev buněčných linií, jejichž růst byl závislý na určitém cytokinu. Když bylo popsáno velké množství cytokinů na základě svého účinku, zjistilo se, že často jsou popisovány různé aktivity téhož faktoru. Byla proto vytvořena standardizovaná nomenklatura, v níž většina cytokinů byla označena jako interleukiny aby se zdůraznila jejich úloha v komunikaci mezi leukocyty.
Protože biochemická purifikace nebyla schopná poskytnout dostatečná množství vyčištěných cytokinů, umožnilo jejich charakterizaci až klonování a exprese cytokinových genů.

Struktura a funkce cytokinů a jejich receptorů:
Interleulin 1 (IL-1):
Přišlo s na něj tak, že thymocyty mohly být stimulovány k proliferaci T mitogenem PHA pouze po přidání media z aktivovaných makrofágů. Faktor produkovaný makrofágy byl nejdříve nazván LAF (lymfocyty aktivující faktor), později byl přejmenován na IL-1.
 IL-1 je produkován řadou buněk zahrnujících monocyty, makrofágy, B lymfocyty, dendritické buňky, fibroblasty, Langerhanzovy buňky, neutrofily, epiteliální a endotelové buňky. IL-1 je těmito buňkami produkován pouze po jejich stimulaci. Jako stimulus pro produkci IL-1 může sloužit fagocytóza bakterií. Lipopolysacharid (LPS) z buněčné stěny gramnegativních bakterií sám indukuje IL-1. Také fagocytóza pevných částic a komplexů Ab-Ag-C stimuluje produkci IL-1 makrofágy stejně jako řada dalších látek jako složky komplementu nebo IFNg . Aktivované TH buňky mohou také indukovat IL-1 produkci makrofágy membránovou interakcí mezi TCR a komplexem MHC-Ag nebo uvolněním určitých cytokinů, jako jsou M-CSF, IFNg nebo TNFb. Během 3 hodin po stimulaci makrofágů jsou uvolňována velká kvanta IL-1.
Ukázalo se, že IL-1 aktivitu mají dva polypeptidy 17 kDa, které se liší nábojem. Jsou kódovány nezávislými geny a je mezi nimi 27% homologie. IL-1 také existuje vázaný na buněčné membráně a aktivuje T buňky při membránové interakci.
Hlavní úlohou IL-1 je aktivace TH buněk, které vyžadují dva typy aktivačních signálů. Specifický signál vzniká při interakci TCR s Ag-MHC II. Tento signál nestačí k indukci TH proliferace a je třeba dalšího kostimulačního signálu. Ten je předán vazbou IL-1 na příslušný receptor na TH membráně. tyto dva signály indukují v TH buňkách transkripci genů pro IL-2, IL-2 receptor, IL-3, IL-4 a IFNg.
IL-1 je značně pleiotropní ve svém účinku. Urychluje zrání a klonální expanzi B buněk po Ag indukované aktivaci. Zvyšuje aktivitu NK buněk a ovlivňuje lokální zánětlivou reakci. Po podání IL-1 in vivo neutrofily opouštějí kostní dřeň, vstupují do cirkulace a pronikají přes stěny kapilár do tkání. IL-1 má na neutrofily a makrofágy chemotaktický účinek. Kromě toho má IL-1 endokrinní efekt a indukuje produkci proteinů akutní fáze jaterními hepatocyty. Působí též na nervový systém a vyvolává horečku, ospalost a nechutenství.

Interleukin 2 (IL-2):
Byl objeven na základě zjištění, že kondiciovaná media z T buněk aktivovaných PHA byla schopná udržet proliferaci T buněk v kultuře (původně byl pojmenován jako růstový faktor T buněk).Tento faktor poprvé umožnil získat klony normálních T buněk. Jeho testování umožnil objev IL-2 dependentních buněčných linií.
Hlavním producentem IL-2 jsou aktivované TH buňky. Během 24-48 hod. po aktivaci začínají TH buňky syntetizovat a sekretovat IL-2 a současně exprimovat vysoce afinní membránový receptor pro IL-2.
IL-2 receptor je tvořen dvěma subjednotkami, 55 kDa subjednotkou a 75 kDa subjednotkou. Obě subjednotky mohou vázat IL-2 s různou afinitou. Alfa subjednotka s nízkou, beta se střední afinitou. heterodimer má vysokou afinitu k IL-2.
NK buňky konstitutivně exprimují beta subjednotku. Aktivované TH buňky exprimují jak vysoce afinní, tak nízko afinní IL-2 receptory. Je asi 5x103 vysoce afinních a asi 10x více nízko afinních receptorů na jedné TH buňce.
IL-2 má zásadní úlohu ve spuštění proliferace T buněk (TH i TC) aktivovaných mitogenem nebo antigenem. Po vazbě na vysoce afinní IL-2 receptor je IL-2 rychle internalizován a spouští T buněčnou proliferaci. Na IL-2 odpovídají pouze T buňky aktivované antigenem, protože klidové T buňky neexprimují vysoce afinní IL-2 receptor. Dokud dochází k interakci mezi T receptorem a komplexem Ag-MHC, je stimulována exprese IL-2 receptoru. Jakmile se interakce přeruší, začne se snižovat exprese IL-2 R. Čili regulací exprese vysoce afinního IL-2 receptoru je modulována klonální expanze zprostředkovaná IL-2.

Interleukin 3 (IL-3):
Aktivované TH buňky produkují množství kolonie stimulujících faktorů, které podporují růst a diferenciaci různých krvetvorných buněk. Faktor, který působí nejdříve, je multi-CSF, stimulující multipotentní hemopoetické buňky. Tento faktor byl přejmenován na IL-3 a kromě vlivu na krvetvorbu přispívá k lokální zánětlivé reakci, stimuluje růst žírných buněk a sekreci histamínu.

Interleukin 4 (IL-4):
Má také široké spektrum biologických účinků na různé typy cílových buněk. Např. vykazuje různý efekt na různá diferenciační stadia B buněk. Na klidové B buňky působí jako aktivační faktor (zvyšuje jejich velikost a expresi MHC II). Po aktivaci antigenem nebo mitogenem působí jako růstový faktor. U proliferujících B lymfocytů působí jako diferenciační faktor tím, že reguluje přesmyk na izotypy IgG1 a IgE.

Interleukin 5 (IL-5):
Podobně jako IL-4 stimuluje proliferaci a diferenciaci B buněk. Zvyšuje produkci IgA a indukuje růst a diferenciaci eosinofilů.

Interleukin 6 (IL-6):
Je produkován aktivovanými TH buňkami, makrofágy, monocyty a fibroblasty. U nádorových buněk funguje autokrinně a stimuluje buněčnu proliferaci. Stimuluje sekreci imunoglobulinů plazmatickými buňkami a společně s IL-1 působí jako kostimulátor aktivace TH buněk.

Interleukin 7 (IL-7):
Indukuje diferenciaci kmenových buněk na progenitorové B buňky. Zvyšuje expresi IL-2 a IL-2 receptoru na klidových T buňkách a tím indukuje T proliferaci.

Interleukin 8 (IL-8):
Je primárně sekrtetován monocyty a má různé účinky na neutrofily. Za jeho přítomnosti nutrofily adherují k endoteliím cév a migrují z krve do tkání proti koncentračnímu spádu IL-8 (aktivní jsou nanogramové koncentrace).

Interleukin 9 (IL-9):
Je sekretován určitými TH klony. Podporuje proliferaci TH buněk za nepřítomnosti antigenu. Může fungovat jako autokrinní růstový faktor u TH2 buněk.

Interleukin 10 (IL-10):
Je důležitým regulačním cytokinem nazvaným inhibiční faktor cytokinové syntézy. Je sekretován subpopulací TH2 buněk a potlačuje produkci cytokinů TH1 subpopulací. TH1 subpopulace sektretuje IL-2 a IFNg a účastní se aktivace makrofágů a oddálené přecitlivělosti. Subpopulace TH2 sekretuje IL-4 a IL-5 a spouští humorální protilátkovou odpověď. Tím, že inhibuje TH1 subpopulaci, hraje IL-10 centrální úlohu v regulaci humorální a buněčné odpovědi.

Interferony (IFN):
Jsou to glykoproteiny produkované různými typy buněk, které interferují s virovou replikací a pomáhají regulovat imunitní odpověď.IFNa je tvořen leukocyty,IFNb je produkován fibroblasty.IFNg  je sekretován T lymfocyty po jejich antigenní nebo mitogenní aktivaci. Všechny tři typy jsou ulolňovány z virem infikovaných buněk a vyvolávají antivirovou rezistenci u sousedních buněk.IFNg má pleiotropní aktivity včetně zvyšování funkční aktivity makrofágů, TC buněk, T buněk angažovaných v DTH a NK buněk. Velmi zajímavým efektem IFN je zvýšení exprese MHC I a MHC II antigenů. Zvýšená exprese MHC II u makrofágů je činí efektivnějšími v prezentaci Ag. IFNg antagonizuje účinek IL-4 na přesmyk protilátkových tříd.

Tumor necrosis factor (TNF) alfa a beta:
TNFa je produkován makrofágy jako reakce na endotoxin. Má přímý cytotoxický účinek na nádorové buňky, ale ne na normální buňky. Má také důležitou úlohu ve vývoji zánětlivé odpovědi.
Jeho produkce však může poškozovat hostitele. Bylo zjištěno, že za rozsáhlý úbytek váhy (cachexie), provázející některé bakteriální a parazitické infekce a tumory je zodpovědný právě TNFa dříve označovaný jako cachetin. Tento cytokin se též účastní bakteriálního toxického šoku.
 Dalším chemicky příbuzným polypeptidem sekretovaným aktivovanými T buňkami je lymfotoxin, nyní označený jako TNFb .Podobně jako TNFa zabíjí nádorové buňky, nepoškozuje normální buňky.

Sekrece cytokinů subpopulacemi TH buněk:
Obě TH1 a TH2 subpopulace produkují pouze IL-3 a GM-CSF, v produkci ostatních cytokinů se liší. TH1 subpopulace může být zodpovědná za odpověď na virové infekce, protože sekretuje IL-2, který aktivuje TC buňky a IFNg  , který má antivirovou aktivitu. TH2 subpopulace se zřejmě účastní odpovědi na parazitické infekce a vyvolává alergické reakce, protože IL-4 a IL-5 indukují produkci IgE a aktivaci eosinofilů. U lidí nebyly tyto subpopulace pozorovány.

Úloha cytokinů v aktivaci lymfocytů:
Aktivace T lymfocytů: Klidové T lymfocyty jsou necyklující buňky v Go fázi buněčného cyklu. Po aktivaci vstupují do buněčného cyklu přes G1 fázi do S fáze, ve které se replikuje DNA. Aktivace klidových T buněk z Go do časné G1 vyžaduje dva tzv. kompetenční signály. První vzniká při interakci komplexu Ag-MHC s TCR, druhý je kostimulační signál IL-1. Po transdukci signálů přes plazmatickou membránu dojde k transkripci řady genů včetně genů pro IL-2 a IL-2 receptor. Následující vazba IL-2 na svůj receptor slouží jako progresivní signál, který umožňuje přechod T buňky z G1 do S fáze.

Aktivace B lymfocytů: Klidové B lymfocyty jsou aktivované antigenem a různými cytokiny produkovanými TH buňkami. Kromě vazby Ag na protilátkové receptory jsou nezbytné kostimulační signály IL-1 a IL-4. Aktivace může být dosaženo též působením B mitogenu LPS nebo pomocí anti-IgM, který se váže na membránový IgM, oba tyto stimuly však musí působit společně s IL-4. Interakce Ag s membránovým protilátkovým receptorem slouží jako kompetenční signál, který uvede klidovou B buňku z Go fáze do časné G1, ve které je schopna odpovědět na IL-4 signál. Interakce s IL-4 působí jako kompetenční signál uvádějící B buňku do pozdní G1 fáze. IL-4 také funguje jako progresivní signál umožňující přechod buňky do S fáze.

Úloha cytokinů v zánětlivé odpovědi:
V odpovědi na infekci nebo poškození tkáně dochází ke kaskádě nespecifických jevů známých jako odpověď akutní fáze. Pod vlivem cytokinů dochází k adherenci zánětlivých buněk na vaskulární endotel a k jejich migraci do tkáně. Výsledkem je příliv lymfocytů, neutrofilů, monocytů, eosinofilů, basofilů a žírných buněk do místa poškození a účast těchto buněk v likvidaci antigenu.
Systemická odpověď zahrnuje vývoj horečky, zvýšenou syntézu hormonů jako ACTH a hydrokortizonu, leukocytózu a produkci proteinů akutní fáze. Zvýšená teplota inhibuje růst patogenů a zvyšuje imunitní odpověď. C-reaktivní protein se váže na mikroby a aktivuje komplement.
Akutní fáze zánětlivé reakce je zahájena aktivací tkáňových makrofágů a uvolněním tří cytokinů: TNFa ,IL-1 a IL-6. Tyto cytokiny působí synergicky a indukují množství lokálních i systémových změn. Pod jejich vlivem dochází ke koagulaci a zvýšení propustnosti cév. TNFa a IL-1 zvyšují expresi adhezivních molekul na cévních endoteliích. Oba cytokiny také působí na makrofágy a indukují produkci IL-8, který zvyšuje adhezi neutrofilů k endotelovým buňkám a současně funguje jako jejich chemotaktický faktor. IFNg chemotakticky přitahuje makrofágy, IFNg a TNFa aktivují makrofágy a neutrofily.
Společné působení IL-1, TNFa a IL-6 vyvolává teplotu, TNF vyvolává sekreci kolonie stimulujících faktorů endoteliálními buňkami a makrofágy.
 Syntéza TNFa, IL-1 a IL-6 je indukována různými stimuly jako viry endotoxinem a cytokiny samotnými. TNFa a IL-1 vzájemně indukují svou expresi nebo expresi IL-6.

Cytokiny a choroby:
Úloha nadprodukce cytokinů v patogenéze může být ilustrována septickým šokem. K vývoji šoku dochází během několika hodin po infekci některými gramnegativními bakteriemi jako Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa aj. Symptomy bakteriálního septického šoku, který je často smrtelný, je pokles krevního tlaku, teplota, průjem a rozsáhlé srážení krve v různých orgánech. Nepomáhá léčba konvenčními antibiotiky. Za šok zodpovídá nadprodukce IL-1 a TNFa makrofágy stimulovanými endotoxinem. Zdá se, že by se mohlo podařit odvrátit šok injekcí monoklonálních protilátek proti těmto cytokinům. Podobně by mohl fungovat rekombinantní antagonista IL-1 receptoru, jehož účinnost byla potvrzena u králíků.

Řada mikroorganismů produkuje toxiny, které fungují jako superantigeny a stimulují T buňky bez ohledu na jejich antigenní specifitu. Superantigeny se váží současně na MHC II molekulu a V doménu T receptoru a aktivují celé rodiny T buněk. Zatím co pouze 1/104-1/106 T buněk odpovídá na konvenční antigeny, 1/4-1/20 T buněk reaguje se superantigeny. Nadprodukce cytokinů stimulovaná superantigeny jako jsou toxiny Staphylococcus aureus nebo Streptococcus pyogenes vyvolává onemocnění z otravy potravinami nebo fatální toxický šok.

Nekontrolovaná produkce lymfokinů hraje úlohu i u některých nádorových onemocnění. Některé B myelomy sekretují IL-6, který slouží jako autokrinní stimulátor jejich růstu. Buňky infikované virem lidské T buněčné leukemie konstitutivně exprimují IL-2 a IL-2 receptor, což je stimuluje k proliferaci.

Cytokinová terapie:
Experimentálně bylo prokázáno zvýšení přežívání transplantátů podáním MAbs proti IL-2 receptoru. TH aktivace byla též blokována klonovaným rozpustným IL-1 receptorem. Odhojení transplntátu bylo potlačeno cytokiny konjugovanými s různými toxíny. Aktivita IL-2 byla úspěšně blokována jeho analogem, který při zachování vazebné aktivity na receptor ztratil biologickou aktivitu.
Naopak u některých imunodeficiencí byly úspěšně použity rekombinantní IL-2, IFNg  a TNFa .
Kultivace různých populací NK buněk nebo TC buněk za přítomnosti vysokých koncentraci IL-2 vedla k vývoji vysoce účinných protinádorových efektorů označovaných jako LAK (lymphokine-activated killer).
Cytokinová terapie by mohla být účinná i při léčbě alergií Selektivní inhibice přesmyku na IgE by mohla mít příznivý efekt u alergiků.
Problémem je nutnost dosažení vysokých lokálních koncentrací cytokinů a jejich velmi krátký poločas.

Vývoj humorální imunitní odpovědi

Během 24 hod. po aktivaci se B buňky zvětšují na lymfoblasty, replikují svou DNA a pak se dělí. Následuje 8-9 cyklů buněčného dělení, každý cyklus trvá 12-15 hod. Pro tuto klonální expanzi je třeba účasti TH buněk. Výsledkem je diferenciace na plazmatické a paměťové buňky. Jestliže se B buňka nepotká se specifickým Ag, hyne během několika dnů (až 90% z 108 B buněk v periferních lymfatických orgánech). Tyto buňky jsou průběžně nahrazovány B buňkami z kostní dřeně (2x107 imunokompetentních buněk za den).

Primární odpověď:
Kinetika primární odpovědi měřená hladinou sérových Ab závisí na druhu Ag a způsobu imunizace. Po lag fázi, během níž dochází ke klonální selekci a diferenciaci na plazmatické a paměťové buňky a která trvá 3-4 dny, je dosaženo vrcholu plazmatických buněk za 4-5 dnů a vrcholu Ab v séru 5.-7. den po podání Ag. První je sekretován IgM, pak IgG. Trvání primární odpovědi závisí na perzistenci Ag (obvykle dny až týdny).

Sekundární odpověď:
Paměťové buňky vzniklé během primární odpovědi zastavují dělení v Go fázi. Některé perzistují po celý život jedince (původní antigenní hřích - imunizace chřipkovou vakcínou ukázala, že ve vyšším titru byly vytvořeny Ab proti jinému než vakcinačnímu kmenu, který infikoval imunizované osoby v mládí). Kromě paměťových B buněk jsou pro vývoj sekundární odpovědi potřebné paměťové T buňky. Sekundární odpověď se vyvíjí rychleji, dosahuje vyších titrů a trvá déle. Produkované Ab mají vyšší afinitu a kromě IgM zahrnují další třídy imunoglobulinů.

Experimentální systémy:
Tvorba Ab může být studována in vitro při kultivaci lymfocytů ve vhodných mediích s fetálním telecím sérem.
Jednotlivé plazmatické buňky mohou být prokazovány in vitro Jerneho plakovou metodou, která má podobný princip jako virový plakový test.
Ze sleziny myši imunizované beraními krvinkami (SRBC) se připraví buněčná suspenze, smísí se s agarem a nadbytkem SRBC a vyleje na Petriho misku. Během inkubace 1 hod při 37oC difundují Ab produkované plazmatickými buňkami do agaru a váží se na SRBC v jejich okolí. Pak se přidá morčecí sérum obsahující komplement, což vede k lýze SRBC obalených protilátkou. To se projeví světlým plakem bez viditelných SRBC. Tímto testem se prokazuje pouze produkce IgM (= přímý PFC test), IgG + C´nezpůsobují lýzu SRBC. Průkaz IgG se provádí po přidání antiizotypového séra a komplementu (= nepřímý PFC test). Počet plazmatických buněk sekretujících IgG se vypočítá odečtením počtu PFC v přímém testu od počtu PFC v nepřímém testu. Plazmatické buňky produkující Ab proti jiným Ag se mohou prokazovat pomocí SRBC, na kterých je tento Ag navázán.
Podobný je princip modernějšího testu ELISPOT, kdy jsou imunní lymfocyty inkubované na Petriho misce s navázaným Ag. Produkované Ab se vážou na Ag v okolí plazmatických buněk. Po odstranění buněk je navázaná Ab prokázána ELISA testem. Výsledkem jsou barevné skvrny odpovídající jednotlivým plazmatickým buňkám.

Antigeny nezávislé na thymu:
Většina Ag potřebuje k aktivaci B buněk TH buňky. Některé Ag však mohou aktivovat B buňky bez asistence TH buněk a jsou označovány jako na thymu nezávislé. Většina z nich jsou polysachridy rezistentní k degradaci v makrofágách. Jejich polymerní struktura umožňuje propojení receptorů na B buňkách, potřebné pro aktivaci. Některé z těchto Ag působí ve vyšších dávkách jako B mitogeny. Humorální odpověď na tyto na thymu nezávislé antigeny je obvykle slabá (pouze IgM), nejsou tvořeny paměťové buňky. Příkladem těchto antigenů jsou bakteriální flagelin, lipopolysacharid, dextran, pneumokokový kapsulární polysacharid atd.

Užití konjugátů hapten-nosič pro studium buněčných reakcí:
V těchto konjugátech funguje hapten jako imunodominantní B epitop. Na rozdíl od konformačních epitopů může být hapten prezentován B buňkám na různých nosičích. Právě pomocí imunizace komplexy hapten-nosič bylo možno prokázat, že pro vývoj protilátkové odpovědi je nutné asociativní rozpoznání antigenu TH a B buňkami, přičemž obě rozpoznávají různé epitopy na témže antigenu.

Jednotlivé kroky při aktivaci, proliferaci a diferenciaci B buněk:
Prezentace antigenu B buňkami:
Na rozdíl od makrofágů zachycují B buňky Ag specificky - endocytózou zprostředkovanou Ig receptorem. Protože před objevem hybridomové technologie bylo obtížné studovat endocytózu antigenu B buňkami (asi jen jedna B buňka z 104 buněk nese receptory specifické pro danný Ag), byl tento problém obejit použitím králičí Ab proti myšímu Ig místo Ag. Anti-myší Ig byl endocytován a zpracován B buňkami jako Ag a příslušné peptidy byly prezentovány spolu s MHC II na B buněčné membráně. Tak bylo poprvé prokázáno, že B buňky jsou právě tak účinné v prezentaci Ag jako makrofágy.
Ikdyž pohlcení Ag B buňkou obecně vyžaduje vazbu Ag na buněčný receptor, při extrémě vysokých koncentracích Ag dochází k jeho nespecifické pinocytóze a prezentaci B buňkami. Metoda se nazývá pulzování B buněk antigenem.
Během 30-60 min. po internalizaci Ag je tento prezentován na membráně spolu s MHC II molekulami. Protože B buňky rozpoznávají Ag specificky pomocí svých Ig receptorů, mohou prezentovat TH buňkám Ag, který je v 1000x nižší koncentraci než v případě makrofágů jako antigen prezentujících buněk.

Tvorba konjugátu TH buňka-B buňka:
Jakmile TH buňka rozpozná zpracovaný Ag spolu s MHC II na membráně B buňky, dojde k vytvoření T-B konjugátu. U TH buněk dochází k reorganizaci Golgiho aparátu a mikrotubulárních center směrem k místu spojení s B buňkou. Tato reorganizace může zajistit uvolnění cytokinů směrem k Ag specifické B buňce. Podobně dochází k redistribuci TCR, CD4 a LFA-1 molekul do oblasti spojení s B buňkou. Shlukování těchto povrchových molekul zvyšuje aviditu této buněčné interakce. Zvýšená avidita prodlužuje dobu spojení mezi TH buňkou a B buňkou a poskytuje čas pro směrovanou sekreci cytokinů.

Přemostění membránových IgM a IgD molekul B buněk antigenem přenáší aktivační signál přes plazmatickou membránu a indukuje sekvenci enzymatických reakcí vedoucí k expresi příslušných B buněčných genů. Nedávno byl na B buňkách nalezen komplex podobný CD3, spojený s membránovým Ig receptorem. Tento komplex zřejmě funguje v přenosu aktivačního signálu podobně jako CD3.

Cytokinové signály:
Aktivace klidových B buněk vyžaduje dva typy signálů. Kompetenční signály zahrnují přemostění receptorů antigenem, kostimulační IL-1 a IL-4 a zřejmě ještě membránové signály související se vznikem T-B konjugátu. Progresivní signál vzniká interakcí s IL-4. Následující proliferaci a diferenciaci stimulují další růstové faktory.
Většina cytokinů zahrnutých v aktivaci B buněk je produkována aktivovanými TH buňkami (kromě IL-1). IL-4 funguje současně jako kompetenční a progresivní signál, kromě toho působí jako proliferační a diferenciační faktor. Pod vlivem IL-4 dochází ke zvýšení exprese MHC II a ICAM molekul na B buněčné membráně. Toto zvýšení způsobuje, že B buňky mohou efektivněji prezentovat Ag a zesiluje interakci s TH buňkami.
Z dalších TH cytokinů IL-2 indukuje sekreci pentamerického IgM. Ikdyž klidové B buňky nemají IL-2 receptor, jeho subjednotky jsou exprimovány pod vlivem IL-4 a IL-5. Vazba IL-2 na tento vysoce afinní receptor indukuje expresi J řetězce, který je nezbytný pro sekreci pentamerního IgM. IL-4 indukuje přesmyk Ab tříd na IgG1 a IgE, TGFb indukuje přesmyk na IgA.

Změny charakteristické pro sekunádrní humorální odpověď:
Pro sekundární odpověď je charakteristické zvýšení afinity protilátek a izotypový přesmyk. Paměťové B buňky mohou být odlišeny od právě dozrálých B buněk na základě povrchových Ig. Čerstvě dozrálé B buňky exprimují IgM a IgD, paměťové B buňky exprimují další izotypy IgG, IgA a IgE. Hladina IgD je u těchto buněk redukována. Podle povrchových znaků CD44 a CD45 se dají odlišit čerstvě dozrálé T buňky od paměťových.
Paměťové B buňky exprimují receptory s vyšší afinitou pro Ag a jsou proto aktivovatelné nižšími koncentracemi antigenu. Paměťové T buňky neexprimují receptory s vyšší afinitou, ale mají vysoce afinní IL-2 receptory a zvýšenou expresi buněčných adhezivních molekul (LFA-1), což zvyšuje aviditu interace mezi buňkami. V průběhu imunitní odpovědi se afinita protilátek zvyšuje 100-10.000x. Je to výsledek dvou procesů, selekce vysoce afinních B klonů a somatických mutací v odpovídajících klonech. Jak postupně klesá koncentrace antigenu, zvyšuje se soutěž mezi B lymfocyty o tento Ag. Nakonec jsou pouze B buňky s vysoce afinními receptory schopné vázat dostatek Ag ke své aktivaci.
První sekretované Ab v primární odpovědi jsou IgM, které jsou postupně nahrazeny IgG. V sekundární odpovědi se produkuje velmi málo IgM a objevují se IgG, IgA a IgE. IL-4 řídí přesmyknutí Ab tříd v pořadí IgM - IgG1 - IgE. Tak aktivace paměťových IgG1 může vést k produkci plazmatických buněk sekretujících IgE.

Indukce humorální odpovědi in vivo:
Ag, který vnikne do těla je koncentrován v lymfatických orgánech. Krevní Ag je filtrován slezinou, tkáňový Ag je zachycován v lymfatických uzlinách. Lymfatická uzlina zachytí víc než 90% Ag z aferentních lymfatických cév. Ag je v uzlině fagocytován makrofágy nebo interdigitujícími dendritickými buňkami nebo je zachycen na specializovaných folikulárních dendritických buňkách. Tyto dendritické buňky zachycují na své Fc receptory komplexy Ag-Ab a uchovávají je dlouho na membráně. Předpokládá se, že mají hlavní roli v aktivaci paměťových buněk. Ag nebo komplexy Ag-Ab vstupují do lymfatických uzlin samy, nebo v transportujících buňkách (Langerhansovy buňky) a v makrofázích. Lymfocyty vstupují do uzlin lymfatickými cévami nebo přes stěnu krevních cév. Dosahují parakortikální oblasti, která je hustě osídlena T lymfocyty a Ag prezentujícími buňkami. Interdigitující dendritické buňky exprimují vysiké hladiny MHC II antigenů a jejich dlouhé výběžky mohou vejít v kontakt až s 200 TH buněk. Ikdyž nemohou fagocytovat, endocytují Ag a prezentují ho lymfocytům. Aktivované TH buňky pak migrují do primárních folokulů. Ve folikulech je mnho B buněk, folikulárních dendritických buněk a makrofágů. Zde dochází k tvorbě B-T konjugátů a aktivované B buňky bytvářejí zóny proliferujících buněk zvané germinální centra. Většina proliferujících B buněk v germinálním centru hyne. Ty, které přežily se vyvíjejí na malé paměťové buňky a velké lymfoblasty, které migrují do dřeně, kde se diferencují na plazmatické buňky. Produkované Ab jsou neseny lymfatickými cévami do hrudního mízovodu, kde vstupují do krve. Paměťové buňky buďto zůstávají ve folikulech, nebo recirkulují.