Buněčná imunita

Je zodpovědná zejména za likvidaci intracelulárních patogenů, virem infikovaných buněk, nádorových buněk a transplantátů. Systém je adaptován na rozpoznání pozměněných vlastních buněk a jejich eliminaci.
Děti narozené bez thymu (DiGeorge syndrom) trpí na časté infekce viry, intracelulárními bakteriemi a houbami.

Přímá cytotoxická odpověď
Efektorové mechanismy se dělí na:
-	antigen specifické T lymfocyty
-	nespecifické cytotoxické buňky, jako jsou NK buňky nebo mikrofágy
Cílové buňky jsou alogenní, nádorové, virem infikované a chemicky konjugované.

Cytotoxicita zprostředkovaná CTL:

Obecně jsou CTL CD8+, MHC I restringované, zřídka CD4+, MHC II restringované.
Imunitní odpověď CTL se dělí na dvě fáze. Fáze senzibilizace zahrnuje aktivaci a rozsáhlou proliferaci TH buněk jako odpověď na prezentaci Ag mikrofágy nebo jinými buňkami. Také dochází k proliferaci TC buněk stimulovaných Ag vázaným na MHC I, ale ta je mnohem menší než u TH buněk. Klonální expanze TH buněk vede ke zvýšení sekrece IL-2. Po aktivaci Ag a IL-2 TC buňky proliferují a diferencují se na CTL. (obr.1)
Ve druhé efektorové fázi CTL rozpoznávají Ag-MHC I komplexy na cílových buňkách a ničí je.

Senzibilizační fáze:

Může být měřena in vitro smíšenou lymfocytární reakcí (MLR) nebo in vivo reakcí štěpu proti hostiteli (GVHR). Během kokultivace alogenních slezinných buněk v MLR dochází k extenzivní blastické transformaci a proliferaci T buněk. Stupeň proliferace se měří inkorporací 3H thymidinu. Během 24-48 hod po stimulaci aloantigeny se T buňky začínají dělit a za 72-96 hod vzniká populace CTL. Odstranění TH buněk zabrání tvorbě CTL. Nutná je též přítomnost akcesorních buněk - mikrofágů. Funkce těchto buněk spočívá v aktivaci TH buněk.

GVH reakce:

Imunokompetentní lymfocyty se injikují do jedince s potlačeným vlastním imunitním systémem, což brání imunitní reakci hostitele proti štěpu. Jako příjemci se používají novorozená nebo ozářená zvířata. U lidí se GVH reakce často rozvine po transplantaci kostní dřeně. Alogenní lymfocyty proliferují v lymfatických orgánech, např. ve slezině. Tato proliferace indukuje příliv hostitelských buněk, které také proliferují, což vede ke zvětšení sleziny - splenomegalii. Pozitivní GVH reakce se pak měří pomocí slezinného indexu:

			            váha exp. sleziny/celk. tělesná váha
			I =        váha kontrol. sleziny/celková těl. váha

Neaktivované TC buňky nejsou schopné cytotoxické aktivity. Tyto CTL prekurzory nemají IL-2 receptor a neproliferují. Rozpoznání Ag-MHC I na cílových buňkách indukuje expresi IL-2 receptoru. Vazba IL-2 produkovaného TH buňkami na tento receptor vede k proliferaci a diferenciaci těchto buněk na CTL. Exprese IL-2 R až po vazbě Ag zajišťuje, že se pouze Ag specifické TC buňky diferencují na CTL.

Efektorová fáze:

Zahrnuje lýzu cílových buněk CTL efektory. Metodou studia je buňkami zprostředkovaná lymfolýza (CML), ve které jsou cílové buňky označeny 51Cr, jehož uvolnění je mírou cytotoxické aktivity efektorových buněk. K poznání efektorové fáze cytotoxické odpovědi přispěly i možnosti vývoje CTL klonů, připravených klonováním diferencovaných CTL za přítomnosti vysokých koncentrací IL-2. Rozpoznávání cílových buněk podléhá histokompatibilní
restrikci (obr. 2).

Mechanismus cytotoxického působení CTL:

Nejprve dochází k tvorbě konjugátu mezi CTL a cílovou buňkou.(obr.3)Tvorba konjugátu zahrnuje rozpoznání Ag-MHC CTL receptorem. Spojení je zesíleno vazbou integrinového receptoru LFA-1 na membráně CTL na adhezivní molekuly (ICAM) na membráně cílové buňky. Aktivace CTL antigenem převádí LFA-1 z  nízkoavidního stavu na vysoce avidní. Vysoce avidní LFA-l perzistuje pouze 5—10 min, pak se vrací do nízkoavidního stavu. To umožňuje oddělení CTL od cílové buňky. Po vytvoření konjugátu dochází k sekvenci událostí vedoucí k poškození membrány cílové buňky. Nejdříve se Golgiho aparát a cytoplazmatická granula koncentrují do místa kontaktu CTL s cílovou buňkou. Příjem Ca2+ indukuje exocytózu obsahu granul do oblasti kontaktu s cílovou buňkou. Granula obsahují performy, proteiny vyvolávající tvorbu pórů, esterázové enzymy — granzymy A—F, vysokomolekulární proteoglykany a toxické cytokiny jako TNFb. Prekurzory CTL nemají granula ani perforin. Po vzniku konjugátu a exocytóze granul jsou z granul uvolňovány monomery performu, které se spojují s buněčnou membránou. po spojení u nich dochází ke konformační změně vedoucí k odkrytí amfifatické domény, která se zanoří do membrány cílové buňky. Monomery pak polymerizují a vytvářejí válcovitý pór s vnitřním průměrem 5-20 min. Těmito póry zřejmě vnikají do cílových buněk lytické substance též obsažené v granulích CTL. Perforin vykazuje sekvenční homologii s C9 složkou komplementu a též tvorba pórů je podobná jako u komplementem zprostředkované lýzy. Samotné CTL zřejmě obsahují membránový protein (protectin), který inaktivuje perforin a brání jeho vazbě s membránou CTL. Tím se CTL chrání před poškozením vlastními lytickými mechanismy.(obr.4a)
Na lýze cílových buněk se zřejmě podílejí i další mechanismy, neboť některé linie CTL nemají detegovatelný perforin, u jiných byl pozorován pomalejší způsob zabíjení založený na poškození jaderné membrány a fragmentaci DNA cílové buňky (apoptosa).

Cytotoxicita zprostředkovaná NK buňkami:

NK buňky představují populaci velkých granulárních lymfocytů, tvořících 5 % populace recirkulujících lymfocytů. Mají některé znaky T lymfocytů, monocytů a granulocytů. Na 90% NK
buněk se váže monoklonální protilátka rozpoznávající Fc receptor pro IgG (CD 16). NK buňky neexprimují T receptory ani CD3. Rozpoznání Ag není restringováno MHC. NK odpověď nevytváří imunologickou paměť. Kromě nádorových buněk NK buňky zabíjejí některé virem infikované cílové buňky. Aktivita NK buněk spadá do období aktivace, proliferace a diferenciace TC buněk na CTL. Význam NK buněk pro obranu proti infekcu vyplývá ze známého případu pacientky s normální T a B imunitou, které zcela chyběly NK buňky. Pacientka trpěla těžkými infekcemi virem planých neštovic a cytomegalovirem. NK buňky exprimují 75 kDa složku IL-2 receptoru, jejich aktivitu zvyšuje IL-2 a interferony, které fungují synergicky a stimulují proliferaci NK buněk. K lýze cilových buněk dochází podobným mechanismem jako u CTL.

Buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách: (obr.4b)

Řada buněk s cytotoxickým potenciálem má membránový receptor pro Fc oblast Ab molekuly. Tyto buňky se mohou vázat na protilátkové molekuly navázané na cílových buňkách a následně je zabíjet. I když jsou tyto cytotoxické buňky nespecifické, specifita je zajišťována protilátkou. Tento typ cytotoxicity je označován jako cytotoxicita závislá na protilátkách (ADCC). Efektory jsou NK buňky, makrofágy, monocyty, neutrofily a eosinofily. ADCC zajišťuje lýzu buněk infikovaných viry, nebo zabíjení cizopasných červů (schistosoma). Vazba efektorových buněk na cíle pomocí Fc receptoru zvyšuje metabolickou aktivitu těchto buněk i obsah lytických komponent jejich granul. Kromě toho aktivované monocyty, makrofágy a NK buňky vylučují TNF, který může mít cytotoxický účinek na cílové buňky. NK buňky a eosinofily též obsahují perforin.

Oddálený typ přecitlivělosti:

Když se některé subpopulace aktivovaných T buněk setkají s určitými typy antigenů, vylučují cytokiny, které indukují lokální zánětlivou reakci zvanou oddálený typ přecitlivělosti (DTH). Reakce je charakterizována mohutným přílivem nespecifických zánětlivých buněk, zejména mikrofágů. Tato reakce byla pozorována už v roce 1890 Robertem Kochem po intradermální injekci filtrátu z Mycobacterium tuberculosis osobám, které prodělaly TBC. DTH sice může za určitých okolností způsobit poškození tkáně, ale tato reakce hraje výraznou úlohu v obraně proti intracelulárním patogenům.

Fáze DTH odpovědi: (obr.5a)

Vývoj DTH odpovědi vyžaduje senzibilizační časový interval 1-2 týdny po prvním kontaktu s Ag. Během tohoto intervalu se komplexem Ag-MHC aktivují TH buňky a klonálně expandují. Jako Ag prezentující buňky funguji Langerhansovy buňky a makrofágy. Sekundární kontakt s Ag indukuje efektorovou fázi odpovědi. V této fázi aktivované T buňky sekretují řadu cytokinů zodpovědných za přísun a aktivaci mikrofágů a dalších nespecifických zánětlivých buněk. Aktivované T buňky jsou obecně CD4+, ale v některých případech mohou i CD8+T buňky indukovat DTH reakci. Aktivované T buňky jsou často označovány TDTH, ale ve skutečnosti je to subpopulace TH buněk. Obecně to trvá 24 hod. po druhém kontaktu s Ag, než se začne rozvíjet DTH odpověď. Vrchol odpovědi je pak za 48-72 hod. po podáni Ag. V době plně rozvinuté DTH tvoří TDTH asi jen 5% účastnících se buněk. Zbytek je tvořen makrofágy a dalšími nespecifickými buňkami. Cytokiny produkované TDTH indukují krevní monocyty k adherenci na endoteliální buňky a migraci z krve do tkáni. Během tohoto procesu se monocyty diferencují na aktivované makrofágy. Aktivované makrofágy vykazují zvýšenou fagocytózu a schopnost zabíjet mikroorganismy. Kromě toho exprimují větší množství MHC II molekul a adhezívních molekul, a proto jsou efektivnější v prezentaci Ag. Většinou je patogen rychle odstraněn a dochází k malému poškození tkáně. V opačném případě se DTH odpověď prodlužuje a intenzivní zánětlivá reakce se vyvíjí v granulomatosní reakci. V granulomu k sobě navzájem těsně adherují aktivované makrofágy, získávají epiteloidní tvar a někdy fúzují v mnohojaderné obrovské buňky. Díky zvýšené koncentraci lysosomálních enzymů uvolňovaných do okolních tkání dochází k jejich destrukci, k poškození krevních cév a rozsáhlé tkáňové nekróze.

Cytokiny zahrnuté v DTH: (obr.5b)

Cytokiny zahrnuté v DTH odpovídají těm, které jsou produkovány TH1 subpopulací. IL-2 funguje autokrinně a zmnožuje populaci T buněk produkujících cytokiny. IL-3 a GM-CSF indukují hematopoézu granulocytů a monocytů.IFNt aTNFb působí na endoteliální buňky a usnadňují pronikáni monocytů a dalších buněk přes cévní stěnu. První se v postižené tkáni objevují neutrofily (za 6 hod)‘ pak monocyty (za 24-48 hod). Monocyty jsou směrovány do místa DTH odpovědi IFNt. Migraci inhibující faktor (což je asi IL-4) brání mikrofágům migrovat z místa DTH reakce. Makrofágy, které se akumulují v místě DTH reakce, jsou aktivovány zejména IFNt. Aktivované makrofágy mohou aktivovat víc TDTH buněk, které sekretují více lymfokinů a tím aktivují více makrofágy.

Ochranná úloha DTH odpovědi:

Řada intracelulárních bakterií a hub (Mycobacterium, Listeria, Brucella, Candida, Pneumocystys carinu) indukuje DTH odpověď, která způsobuje destrukci buněk nesoucích vnitrobuněčné patogeny. Význam DTH v obraně proti těmto patogenům je ilustrován u AIDS. Infekce HIV způsobuje výraznou ztrátu CD4+ T buněk, což vede ke ztrátě DTH odpovědi. Pacienti s HIV často těžce onemocní tzv. oportunními infekcemi intracelulárními bakteriemi, houbami či prvoky.

Detekce DTH reakce in vivo a in vitro:

Intradermá1ní injekce Ag vede ke vzniku charakteristické kožní léze. Pozitivní kožní test prokazuje, že jedinec má populaci senzibilizovaných TDTH buněk specifických pro testovací Ag. Injekce PPD, proteinu ~5uněčné stěny mykobakterií, vyvolá u jedinců v minulosti exponovaných Mycobacterium tuberculosis začervenalou lehce nateklou tvrdou lézi v místě vpichu.
In vitro se DTH měří pomocí produkce migraci inhibujícího faktoru (MIF), který je sekretován aktivovanými TDTH buňkami. Lymfocyty jsou nejprve kultivovány za přítomnosti Ag a prezentujících buněk. Supernatanty z těchto kultur jsou naplněny spolu s makrofágy do skleněných kapilár, které jsou horizontálně umístěny do kultivačního media. Zatímco v kontrolách makrofágy migrují ven z kapilár, za přítomnosti MIF zůstávají v kapiláře.

Regulace imunity a imunologická tolerance

Po každém podání Ag je regulačními mechanismy určena větev imunitního systému, která bude aktivována, intenzita odpovědi a délka trvání.
Už samotný Ag působí jako regulátor. Bakterie, bakteriální produkty a rozpustné proteiny indukují produkci humorálních Ab, intracelulární bakterie a viry indukují buněčnou imunitu.
V některých případech přítomnost kompetujícího Ag může regulovat odpověď na nepříbuzný Ag. Např. odpověď na koňské erytrocyty je výrazně redukována předchozí imunizací beraními krvinkami. Jde zřejmě o soutěžení o prezentující buňky a tím aktivaci T buněk.
Protilátky vykazují inhibici zpětnou vazbou na svou vlastní produkci. Je-li zvíře imunizováno antigenem injikovaným se specifickou Ab, nebo je tato Ab podána do 5 dnů po Ag, imunitní odpověď na Ag je snížena až 100X. Mluví se o supresi zprostředkované protilátkou. Pasivně podané Ab zřejmě soutěží s B receptory o Ag, takže B buňky nemohou klonálně expandovat. Tato kompetice směruje B buněčnou odpověď k vyšší afinitě produkovaných Ab. Právě kvůli supresi zprostředkované protilátkou nejsou některé vakcíny podávány dětem mladším jednoho roku. Hladina přirozeně získaných mateřských IgG Ab transplacentárním přenosem přetrvává 6 měsíců po porodu. Když jsou novorozenci imunizováni vakcínou proti spalničkám nebo příušnicím, způsobí přítomnost mateřských protilátek nízkou Ab odpovědí a špatný vývoj imunologické paměti.
Na druhé straně podání antiséra proti Rh antigenu Rh- matkám S Rh+ prvním dítětem brání jejich senzibilizaci Rh Ag při porodu a tím zabraňuje vývoji Rh-reaktivních paměťových buněk, což významně snižuje riziko sekundární mateřské IgG odpovědi na fetální Rh+ krev během následujícího těhotenství.

Regulace zprostředkovaná cytokiny:

Již dlouho bylo známo, že produkce humorálních Ab a TDTH jsou v inverzním vztahu. Může to být vysvětleno složením cytokinu produkovaných během imunitní odpovědi. Je známo, že TH1 subpopulace zprostředkuje DTH, zatímco TH2 subpopulace podporuje tvorbu protilátek. IFNt produkovaný TH1 buňkami inhibuje proliferaci TH2 buněk a IL-10 produkovaný TH2 buňkami inhibuje produkci cytokynů TH1 buňkami.
Regulační funkce cytokinů také zahrnuje výběr Ig izotypů. Přesmyk u B buněk aktivovaných LPS na IgGl a IgE je indukován IL-4, ale za přítomnosti IFNt je působení IL-4 blokováno. Takže rovnováha mezi IL-4 a IFNt produkovanými během imunitní odpovědi reguluje hladiny IgGl, IgE a IgG2a.

Idiotypová regulace: (obr.6)

Současné odhady ukazují, že imunitní systém je schopen produkovat řádově 1011 protilátkových specifit a 1015 - 1018 TCR specifit. Protože myš produkuje pouze 108 lymfocytů za den, je během života myši exprimována pouze část tohoto potenciálu. protože protilátky a T receptory nejsou exprimovány během fetálního vývoje imunitního systému, jejich variabilní oblasti mohou být rozpoznávány imunitním systémem jako cizí.
V roce 1973 formuloval Niels Jerne svou teorii imunologické sítě, za kterou dostal v roce 1985 Nobelovu cenu. Podle této teorie každá protilátka indukovaná antigenem indukuje tvorbu Ab proti své variabilní oblasti. Jednotlivé Ag determinanty variabilní oblasti se nazývají idiotopy a  jejich suma je idiotyp. V některých případech je idiotop identický s vazebným místem pro Ag - paratopem, jindy leží idiotopy vně paratopu. během Ab odpovědi primární Ab indukují tvorbu sekundárních Ab, tzv. antiidiotypových Ab (Ab2). Proti jednotlivým idiotopům na Ab2 se tvoří Ab3 atd. Ab3 někdy napodobují Abl, a tak se síť sama limituje sníženou produkcí Ab v každé následné aktivaci.
Antiidiotypová regulace může fungovat i u T buněk, protože T receptory obsahují též variabilní oblasti. idiotypová síť představuje komplex interagujících buněk, který funguje bud zesílením nebo potlačením imunologické aktivace.
Základním principem teorie je to, že některé antiidiotypové protilátky reagující s paratopem nesou vnitřní obraz původního antigenního epitopu. Tyto antiparatopové protilátky napodobující původní epitop udržují imunitní systém aktivovaný i v nepřítomnosti původního Ag. To může zajišťovat dostatečnou klonální proliferaci a produkci paměťových buněk.
Antiidiotypové protilátky byly úspěšně použity k indukci protektivní imunity proti virům vztekliny, sérové hepatitidy B, listeriím, streptokokům, trypanosomám a schistosomám.(obr.7a)

Suprese zprostředkovaná T buňkami:

Když jsou zvířata imunizována velkými dávkami Ag, stávají se tolerantní neboli neodpovídá na tento Ag. tato neodpovídavost může být přenesena na syngenní myši T buňkami zvanými proto supresorové (TS) buňky. Bylo prokázáno, že supresivní efekt je Ag specifický. V některých případech TS buňky uvolňovaly supresorické faktory, některé Ag specifické, jiné idiotypově specifické.
Zatím se však nepodařilo najít jediný membránový znak charakterizující TS subpopulaci. podobně se nepodařilo ustavit T buněčný klon se supresorovou aktivitou, ani naklonovat Ag specifické supresorické faktory. Zdá se, že specifická subpopulace T buněk neexistuje a že imunologická suprese může být zprostředkována známými subpopulacemi lymfocytů.
Experimentálně bylo prokázáno, že domělý efekt supresorických T lymfocytů byl způsoben vyčerpáním IL-2 jinými než sledovanými buňkami. V jiným případech může být suprese způsobena antagonickým působením cytokinů. např. je-li určitá imunitní odpověď závislá na IL-2, produkce IL-10 potlačí takovou odpověď. Protože je ve většině experimentálních systémů monitorován pouze jeden typ odpovědi, může být přesmyk na jiný typ odpovědi považován za supresi.
V některých případech může být suprese zprostředkována T buňkami s cytotoxickou aktivitou. Byly prokázány MHC II restringované CTL schopné selektivně zabíjet buňky prezentující Ag.

Indukce imunologické tolerance:

Imunologická tolernace k vlastním antigenům se vyvíjí během zrání imunitního systému, experimentálně indukovaná tolerance znamená neodpovídavost na Ag, který je normálně imunogenní.

Fetální a neonatální indukce tolerance:

Už v roce 1945 pozoroval Owen, že neidentická dvojčata narozená kravám, jejichž placenty zfúzovaly v časném vývojovém stadiu (což vedlo ke smíšení cirkulujících buněk a antigenů) byla tolerantní k antigenně odlišným krevním buňkám druhého dvojčete. Burnet toto zjištění později formuloval tak, že rozpoznání vlastního je cosi, co se musí jedince naučit a co není dědičné. Ukázalo se, že pro vývoj tolerance je důležité přežívání alogenních buněk v chimerickéin jedinci, zatímco proteinové antigeny jsou rychle likvidovány fagocyty. Indukce tolerance u novorozených myší vyžaduje 100X nižší koncentrace proteinových Ag než u dospělých myší, což odporuje představu, že nezralé lymfocyty se mohou snáze naučit toleranci než zralé. Existuje představa, že interakce nezralých B buněk s vlastními Ag indukuje ztrátu IgM receptoru a tím způsobuje toleranci k vlastnímu.

Indukce tolerance v dospělosti:

Pro navození tolerance je důležitý způsob podání Ag. Nejvýhodnější je intravenózní injekce. Dobrými tolerogeny jsou Ag, které se obtížně fagocytují a zpracovávají makrofágy (deagregované proteiny, polymery D aminokyselin).
Imunizace různými dávkami bovinního sérového albuminu (BSA) ukázala, že existují dvě zóny tolerance v závislosti na dávce antigenu. Dávky nad 10 mg a pod 1 mg s maximem 1 ng. Mezi těmito zónami byla imunogenní zóna.(obr.7b)
Tolerance může být indukována u T i B buněk, které se však liší dávkou Ag potřebnou k indukci tolerance a délkou trvání tolerantního stavu. Thymocyty se stávají tolerantními dříve a zůstávají tolerantní déle než buňky kostní dřeně.

Mechanismus indukce tolerance:

Kontakt vlastního Ag s receptorem na nezralých T a B buňkách indukuje buďto smrt těchto buněk (klonální delece), nebo stav neodpovídavosti (klonální anercrie), kdy jsou lymfocyty reagující s Ag přítomny, ale jsou funkčně neaktivní.
K indukci tolerance u nezralých T a B buněk dochází v lymfatických orgánech během zrání. Je však obtížné si představit, že všechny možné vlastní antigeny mají přístup do kostní dřeně nebo thymu. Zdá se, že jsou produkovány imunokompetentní T a B buňky s receptory pro vlastní Ag. U těchto zralých periferních lymfocytů musí být též indukována tolerance k vlastním Ag. To je zvláště důležité u B  buněk, jejichž receptory se během vývoje imunitní odpovědi mění díky somatickým mutacím. jednou z možností je, že zatímco interakce s Ag za přítomnosti kostimulačního signálu od TH buněk vede k imunitě ‚interakce s Ag bez kostimulačního signálu vede k toleranci.(obr.8)
	To by mohlo mít obrovský význam pro alergiky, u kterých by podání alergenu společné s blokátorem sekundárního signálu indukovalo stav alergie k alergenu.