Transplantační imunologie

Autoštěp - vlastní tkáň přenesená z jednoho místa na těle na druhé (popáleniny).
Isoštěp - mezi geneticky identickými jedinci (monozygotická. dvojčata).
Aloštěp - mezi geneticky odlišnými jedinci téhož druhu.
Xenoštěp - mezi odlišnými druhy.
	Odhojeni štěpu vykazuje specifitu a paměť. Kožní štěpy jsou odhojovány rychleji než vaskularizované tkáně jako ledviny nebo srdce.
	Během primárního odhojeni štěpu (first-set rejection) je vaskularizovaný transplantát infiltrován lymfocyty, monocyty a dalšími zánětlivými buňkami, zvyšuje se vaskularizace, nekróza započíná 10. den a k úplnému odhojeni dojde 14. den. Při sekundární odpovědi (second-set rejectíon) dojde k úplnému odhojení štěpu za 5 –6 dnů (obr.1).
	Imunita ke štěpu může být přenesena lymfocyty, nikoli sérem. Nahé myši (nude mice), které nemají thymus, nejsou schopné odhojit aloštěp a přijímají dokonce xenoštěpy. Odhojení aloštěpu se účastni jak CD4+, tak CD8+ subpopulace, přičemž obě subpopulace spolupracují. 

Transplantační antigeny:
	Antigenně podobné tkáně jsou histokompatíbilní a při transplantaci neindukují imunitní odpověď, Histokompatibílitní Ag jsou kódovány více než 40 odlišnými lokusy, nejdůležitější pro odhojení jsou antigeny hlavního histokompatíbilního komp1exu (MHC). MHC geny jsou obvykle děděny jako jeden haplotyp od každého rodiče. Když se kříží dva inbridní kmeny myší, získává F1 potomstvo jeden haplotyp od každého rodiče a přijímá jejich štěpy. Při křížení outbridních myší je pouze 25% šance, že dva sourozenci budou dědit stejné MHC haplotypy. To má význam při transplantacích mezi sourozenci. Při transplantaci z rodiče na potomka, dárce a příjemce budou vždy sdílet jeden haplotyp a budou se 1išit ve druhém.

Mechanismus odhojení štěpu:
.	Cizí MHC I a MHC II molekuly jsou rozpoznávány CD8+ a CD4+ buňkami, protože napodobují vlastní MHC asociované s antigenem. Antigen prezentující buňky mohou vstupovat do štěpu, endocytovat cizí aloantigeny a prezentovat je s vlastními MHC molekulami. Efektorové lymfocyty vznikají v regionálních uzlinách, vracejí se do štěpu a poškozují ho. V některých štěpech (ledviny, thymus) jsou populace tzv. cestujících 1eukocytů (passenger  1eukocytes) (obr.2a) což jsou leukocyty dárce, které migrují ze štěpu do regionálních lymfatických uzlin a protože nesou alogenní MHC antigeny, stimulují zde T lymfocyty příjemce. Bylo zjištěno, že tyto cestující leukocyty jsou dendritické buňky, které exprimují molekuly. Odstranění těchto buněk ze štěpu prodloužilo jeho odhojení. Další buňky, které významně prezentují aloantigeny imunitnímu systému příjemce jsou Langherhanzovi buňky a endotelie vystýlající krevní cévy. Oba. typy buněk exprimují MHC I i MHC II. Proliferace T buněk po rozpoznání cizích aloantigenů může být prokázána in vitro směsnou lymfocytární reakcí (MLR). Hlavně proliferují CD4+T buňky, což jsou aktivované TH buňky ‚ které hrají centrální úlohu v indukci efektorových mechanismů při odhojováni štěpu.
Efektorové mechanismy zahrnuji DTH a. cytotoxicitu zprostředkovanou CTL. Méně častá je lýza protilátkou a komplementem nebo ADCC. Příliv T buněk a makrofágů do štěpu připomíná DTH reakci. Buňky s cizími a1oantigeny jsou likvidovány CD8+ nebo CD4+ CTL. Centrální úlohu hraji cytokiny sekretované TH buňkami. Nejdůležitější jsou IL - 2, IFNg a TNFb. IL - 2 je nezbytný pro vznik CTL. IFNg podporuje příliv makrofágů a aktivuje je. TNFg má přímý cytotoxický účinek na transplantované buňky. Řada cytokinů zvyšuje expresi MHC I a MHC II na transplantovaných buňkách, což má význam pro jejich snadnější rozpoznávání CTL (obr. 2b)

Klinika odhojeni štěpu:
 - Hyperakutní odhojení: štěp odhojen téměř ihned, takže se vůbec nevaskularizuje (obr. 3). Hyperakutní reakce je způsobena preexístujícími hostitelskými protilátkami, specifickými pro Ag štěpu. Komplexy Ab-Ag aktivují komplement, což vede k intenzivní infilitraci neutrofilů do štěpu. Zánětlivá reakce vede k ucpání kapilár, což brání vaskularizaci štěpu.
- Akutní odhojení začíná asi 10 dnů po transplantaci. Histologické vyšetření ukazuje masivní infiltraci makrofágy a  lymfocyty.
- Chronické odhojení zahrnuje humorá1ní a buněčnou odpověď. Špatně se ovlivňuje imunosupresivy.

Typizace tkání:
Protože jsou za odhojovací reakce zodpovědné krevně skupinové a MHC antigeny, byly vyvinuty postupy typizace tkání umožňující testovat pravděpodobnost tkáňové kompatibility mezi dárcem a. příjemcem štěpu.
HLA typizace se provádí mikrocytotoxickým testem pomocí komplementu a MAbs proti různým MHC I a MHC II alelickým produktům (obr. 4a).
Ke zjištění kompatibility v MHC II se užívá jednocestná MLR. Lymfocyty donora se ozáří nebo ovlivní mitomycinem C a použijí se jako stimulátorové buňky. Proliferace lymfocytů příjemce se měří inkorporací 3H thymidinu.

Imunosupresivní terapie:
Alogenní transplantace vyžaduje určitou imunosupresi. Nevýhodou je nespecifita většiny imunosupresivních látek, což vede ke zvýšenému nebezpečí infekce. Mnoho imunosupresiv sice zpomaluje proliferaci aktivovaných lymfocytů, ale současně poškozuje rychle se dělící buňky kostní dřeně nebo střeva.

Mitotické inhibitory: 

Azathioprin (imuran) se často podává před a po transplantaci k potlačení proliferace T buněk. Působí na buňky v S fázi tím, že blokuje syntézu kyseliny inosinové.
Cyklofosfamid - alkylační látka poškozující DNA.
Kortikosteroidy jsou hormony, deriváty cholesterolu. Procházejí přes cytoplasmatickou membránu, vážou se na receptory v cytosolu a jsou transportovány do jádra, kde se vážou na regulační sekvence DNA. Mají silně protizánětlivý účinek. Jejich aplikace vede k odstranění cirku1ujícich lymfocytů. U některých zvířat způsobují lymfolýzu, u člověka ovlivňují cirkulaci lymfocytů. Také potlačují fagocytární a zabíjecí schopnost makrofágů a neutrofilů.
Cyklosporin specificky suprimuje T lymfocyty aktivované antigenem. Blokuje transkripční aktivaci genů TH buněk kódujících IL-2, IL-4 a IFNg.Potlačuje i expresi IL-2 receptoru.
Ozáření lymfatického systému:
Využívá toho, že lymfocyty jsou extrémně citlivé k rentgenovému záření. Příjemci se ozařuji před transplantací a nově produkované lymfocyty jsou tolerantnější k antigenům štěpu.
Antilymíocytární serum:
Pro lidské transplantace se připravuje imunizací koní nebo králíků lidskými lymfocyty. Odstranění lymfocytů zřejmě není způsobeno jejich lýzou komplementem, ale opsonizací a fagocytózou vlastními fagocyty.
Terapie monoklonálními protilátkami:
Měla by umožnit náhradu generalizované imunosuprese antigen specifickou supresí, aby se snížilo riziko infekce pacienta. Např. byly úspěšně použity Mabs proti IL-2 receptoru, který se exprimuje pouze na aktivovaných buňkách. K prodloužení přežití transplantátu vedlo i podání anti – CD4 Mab. Podobný efekt měly i MAbs proti cytokínům TNFb, IFNg nebo IL-2.

Transplantace kostní dřeně:
Používá se při léčbě leukemií, lymfomů a imunodeficiencí obecně. Stěp obsahuje asi 109 buněk na kg váhy příjemce.
Protože štěp obsahuje imunokompetentní buňky, může působit proti buňkám hostitele a vyvolat reakci štěpu proti hostiteli (GVHR), která postihuje 50-70% pacientů s transplantovanou kostní dření. GVHR může vést ke krvácení do trávicího traktu nebo selháni ledvin. K potlačení GVHR se užívá imunosupresivní léčba po transplantaci (cyklosporin, methotrexát), nebo odstranění T buněk ze štěpu před transplantací pomocí MAbs nebo specifických antisér.

Úspěšnost transplantací stoupla v současnosti na 90% u ledvin a 80% u srdce, nižší je  jater a pankreatu (obr.4b). Velkou šanci na přežití mají transplantace v místech, které nejsou pod imunologickým dozorem (rohovka, varlata, mozek) .

Protinádorová imunita

-	Nádor benigní: není schopen neomezeně růst a neinvaduje zdravou okolní tkáň.
-	Nádor maligní: s nekontrolovaným růstem, který je progresivně invazivní. Rakovina se týká maligních tumorů.
-	Metastázy: jsou shluky nádorových buněk přenesené krví nebo lymfatickými cévami do dalších tkání, kde proliferují.
-	Karcinomy: jsou nádory z ektodermálních nebo endodermálních tkání, jako je kůže nebo epiteliální výstelky vnitřních orgánů a žláz.
-	Sarkomy: jsou odvozené z mezodermální pojivové tkáně jako je kost, tuk, nebo chrupavka.
-	Leukemie a Lymfomy: jsou maligní nádory hemopoetických buněk kostní dřeně. 

Většina nádorů pochází z jedné nádorové buňky, která má defekt v regulaci, takže nádory jsou většinou monoklonální Základní charakteristikou nádorových buněk je jejich nekontrolovaný invazivní růst. Přitom rychlost růstu nádorů nemusí být nejvyšší v organismu. Např. regenerující jaterní buňky rostou rychleji než hepatomy. Nádorové buňky také ztrácejí tkáňově specifickou afinitu, což jim umožňuje růst mimo hranice původní tkáně a metastázovat, v odlišných tkáních. Některé nádory zřejmě získávají homing receptory, které jim umožňují napadat specifické tkáně(obr.5)
Nádorové buňky mají zvýšenou glykolytickou aktivitu, která jim umožnuje růst při snížené dodávce kyslíku. Řada nádorů sekretuje faktory indukující tvorbu krevních cév uvnitř nádoru, sloužících k jeho zásobování kyslíkem a živinami. 
Nádorové buňky jsou většinou aneuploidní kromě toho vykazují delece, translokace a duplikace genů. 
Zatímco normální buňky mají omezený počet dělení in vitro a vykazují inhibici růstu při dosaženi určité hustoty, nádorové buňky narůstají do mnohem vyšších denzit a počet jejich dělení in vitro je neomezený. Nádorové buňky nevyžaduji tolik růstových faktorů jako normální buňky a některé mohou růst in vitro dokonce bez přiidání séra.

Maligní transformace buněk:
Působení chemických kancerogenů, záření nebo některých virů může změnit morfologii a růstové vlastnosti buněk. Maligní transformace vede ke vzniku buněk, které po injikování do zvířete vyvolají vznik nádoru.
Mezi chemickými mutageny jsou alkylační látky přímo mutagenní, jiné se stávají karcinogeny až po enzymatické změně v těle. Mezi fyzikální mutageny patří ionizující a ultrafialové záření. UV záření indukuje tvorbu thyminových dimerů, ionizující záření způsobuje chromozomové zlomy.
Mezi viry indukující maligní transformace patří virus Rousova sarkomu (ptačí retrovirus) nebo DNA viry polyomu a SV4O. RNA transformujících retrovirů se integruje do genomu hostitelské buňky a nádorová transformace je spojována s přítomností onkogenů nesených retrovirem.

Howard Temin (1971) formuloval teorii, podle které normální buňky obsahuji tzv. protoonkogeny, které se mohou lišit od virových onkogenu pouze bodovými mutacemi. Podle současných názorů je většina onkogenů odvozena od buněčných genů kódujících různé růstové proteiny. V normálních buňkách jsou protoonkogeny exprimovány v nízkých hladinách a exprese je často omezena na určitá stadia buněčného cyklu a buněčné diferenciace. Různé produkty onkogenů fungují jako růstové regulátory (růstové faktory nebo jejich receptory) a jejich exprese je u normálních buněk pečlivě regulována. Jiná. skupina onkogenových produktů přenáší signály z membrány na sekundární přenašeče, které regulují genovou aktivitu nebo jiné buněčné funkce. Protoonkogeny mohou být konvertovány na onkogeny při přeskupovaní genů díky změně regulace jejich exprese. K podobnému efektu může dojít mutací protoonkogenů. Řada nádorů exprimuje zvýšené hladiny růstových faktorů a jejich receptorů. Např. T buňky infikované virem HTLV konstitutivně exprimují IL-2 a IL-2 receptor, což vede k autostimulaci jejich proliferace(obr.6)

Nádorové antigeny:
Dělí se na nádorově specifické (TSA) a s nádory spojené (TAA). TSA se vyskytují pouze na nádorových buňkách, TAA se vyskytují i na normálních buňkách za podmínek, které neindukují stav imunologické tolerance. TAA mohou být antigeny, které jsou na normálních buňkách během fetálního vývoje, nebo jsou na normálních buňkách přítomny v extrémně nízkých koncentracích. Většina nádorových antigenů neindukuje humorální Ab, ale indukuje buněčnou odpověď. Protože přítomnost nádorových Ag vyvolávajících CNI byla prokázána odhojením nádorů transplantovaných do syngenních příjemců, jsou tyto Ag označovány jako nádorově specifické transplantační antigeny nebo s nádory spojené transplantační antigeny.
Nádorově specifické Ag byly prokázány u nádorů indukovaných chemickými a fyzikálními karcinogeny a některými viry. Když tentýž chemický kancerogen indukuje nádory na odlišných místech těla jednoho zvířete, tyto nádory se liší svými nádorovými antigeny a imunita k jednomu nádoru nechrání před druhým nádorem. Na rozdíl od toho, všechny nádory indukované jedním virem exprimují stejné nádorové antigeny. Např. u viru SV4O s1ouží jako nádorové specifický Ag časný virový antigen označený velké T. U viru polyomu je tímto Ag časný virový protein zvaný střední T. V obou případech nejsou nádorové Ag součástí obalových proteinů virionu, ale jsou primárně exprimovány v jádře nádorových buněk. Tyto Ag mohou být zpracovány a prezentovány s MHC I nebo MHC II molekulami na membráně nádorových buněk a aktivovat TC nebo TH buňky.
Většina nádorových Ag není specifická pro nádorové buňky, ale je přítomna i na normálních buňkách.Tyto Ag mohou být exprimovány pouze na fetálních buňkách nebo jsou v nízkých koncentracích na normálních a ve vysokých na nádorových buňkách. Jako Ag spojené s nádory slouží např. receptory pro růstové faktory.

Onkofetální antigeny:
Vyskytují se v dospělosti na nádorových buňkách, jsou rozpoznávány jako cizí a indukují imunitní odpověď. Příkladem jsou alfafetoprotein a karcinoernbryonický antigen.

Imunitní odpověď na nádory:
Chemicky nebo jinak indukované nádory vyvolávají silnou imunitní odpověď. Nádory, které vznikají spontánně ve zvířatech, jsou málo imunogenní. Myši nesoucí nádory vytvářeji TC buňky specifické pro nádorové buňky. Tyto CTL mohou být testovány buněčnou lymfolýzou (CML) in vitro. Mezi efektorové mechanismy těchto buněk patří perforiny a TNFb (lymfotoxin).
Normální zvířata mají vysoké hladiny lymfocytů, schopných zabíjet řadu nádorových buněk. Jsou to NK – buňky, velké granulární lymfocyty, které nemají membránový Ig ani T receptor. Neví se, jak NK buňky rozpoznávají nádorové cíle, rozpoznání není MHC restringováno. Zabíjení probíhá podobným mechanismem jako u CTU navíc NK buňky sekretují rozpustný faktor cytotoxický pouze pro nádorové buňky.
U béžových myší s defektem v aktivitě NK buněk je pozorován zvýšený výskyt určitých typů nádorů. Kromě NK buněk některé TC buňky s ab nebo gd receptory nespecificky rozpoznávají a zabíjejí nádorové buňky. Jsou označovány jako NC (natural cytotoxic) buňky. Aktivita NK i NC buněk může být in vitro zvýšena působením IFNg nebo IL-2. 
Makrofágy často obalují nádory a jejich přítomnost je spojována s regresí nádoru. Aktivace makrofágů IFNg a makrofágy aktivujícím faktorem (MAF) zvyšuje jejich cytotoxicitu pro nádorové buňky. Aktivované makrofágy sekretují zvýšená množství enzymů, které dosahují vysokých lokálních koncentrací. Potentním protinádorovým cytokinem je TNFa.
Humorální Ab indukované nádorovými antigeny mohou aktivovat komplement, anafylatoxiny indukují degranulaci žírných buněk a uvolněné mediátory umožňují příliv zánětlivých buněk. Ab se mohou účastnit ADCC, kde jako efektorové buňky vystupují NK buňky nebo makrofágy. Na druhé straně mohou specifické Ab blokovat lýzu nádorových buněk CTL zřejmě maskováním nádorových antigenů.

Mechanismy umožňující nádorovým buňkám uniknout imunitnímu systému:
Séra, získaná imunizací zabitými nádorovými buňkami nebo séra ze zvířat s progresivním růstem nádorů blokují CML reakci, zatím co séra z jedince s regredujícími nádory nemají blokační aktivitu. Blokujícími faktory nejsou většinou samotné Ab, ale imunní komplexy. Imunní komplexy blokují CML in vitro blokováním nádorových antigenů nebo vazbou na FC receptory TC buněk. Některé nádorové specifické Ag mizí z nádorových buněk za přítomnosti sérových protilátek. Jev se nazývá antigenní modulace.
Maligní transformace je často spojena s redukcí exprese MHC I antigenů.
Imunoterapie nádore:
Některá adjuvancia zvyšují protinádorovou odpověď. Nejčastěji se užívá BCG, který aktivuje makrofágy k vyšší produkci IL-1, stimulující TH buňky. BCG má nejlepší efekt, když je injikován přímo do nádoru. Z dalších adjuvancií se užívá Corynebacterium parvum a levamisol.
Klonování genů pro cytokiny umožnilo cytokinovou terapii nádorů. Jde však o zásahy do složité rovnováhy cytokinů a systémové podání některých cytokinů má těžké důsledky ohrožující život. Rekombinantní interferony měly slibný účinek při léčbě nádorů. Všechny 3 typy IFN zvyšují expresi MHC I Ag na nádorových buňkách, IFNg zvyšuje expresi MHC II na makrofázích.Tím se zvyšuje aktivita CTL proti nádorovým buňkám. Kromě toho interferony inhibují dělení normálních a maligních buněk in vitro. IFNg navíc zvyšuje aktivitu TC buněk, makrofágů a NK buněk.
TNFa a b mají přímou protinádorovou aktivitu. Zabíjejí některé nádorové buňky a snižují proliferaci jiných. TNFa inhibují vaskularizaci indukovanou nádorem. Nejúčinnější je injekce TNF přímo do nádoru. Problémem léčby pomoci TNF je jeho extrémně krátký poločas, vyžadující časté injekce TNF, a některé negativní vedlejší účinky.
Další možnou léčebnou metodou je aktivace lymfocytů pacienta in vitro kultivací s ozářenými nádorovými buňkami za přítomnosti IL-2. Aktivované lymfocyty jsou pak injikovány do pacienta. Tyto tzv.LAK (lymphokine activated killer) buňky jsou heterogenní populací zahrnující NK a NC buňky.
Jiným přístupem je získání lymfocytů infiltrujících tumor pomocí biopsie a pomnožení těchto buněk za přítomnosti IL-2 in vitro. Tyto buňky se podobají LAK buňkám, ale k jejich aktivaci je třeba lOOx méně IL-2 než u LAK buněk.
Morioklonální protilátky mohou být při léčbě nádorů využity jako imunotoxiny. Jiným přístupem je nespecifická aktivace T buněk pomocí MAb proti CD3 antigenu. MAbs mohou být užity jako můstky mezi aktivovanými T buňkami a nádory. K tomuto účelu se připravují hybridní protilátky se specifitou pro nádorové antigeny a CD3 molekuly TCR komplexu. Novým přístupem je příprava vakcíny z pacientova nádoru. Nádorové buňky se zabijí ozářením a. injikuji pacientu spolu s BCG.